5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau đây:

5.1. Máy lắc thẳng đứng hoặc máy lắc ngang, có thể điều chỉnh được.

5.2. Giấy lọc gấp nếp, đường kính 24 cm (ví dụ xenluloza dùng cho kết tủa mịn).

5.3. Bình nón, có nắp vặn hoặc nắp thủy tinh.

5.4. Giấy lọc sợi thủy tinh nhỏ, đường kính 5 cm (ví dụ cỡ lỗ 1,6 mm).

5.5. Bình chứa, 75 ml có bộ phận kết nối đầu tip Luer dùng cho IAC.

5.6. Bơm tay, xyranh 20 ml có khóa Luer hoặc nắp cao su dùng cho IAC.

5.7. Bình định mức, dung tích 5 ml, 10 ml và 20 ml, có độ chính xác ít nhất 0,5%.

...

...

...

5.8. Bơm dùng cho HPLC, thích hợp đối với tốc độ dòng ở (1,000 ± 0,005) ml/min.

5.9. Hệ thống bơm

Hệ thống bơm cần phù hợp cho việc bơm vòng (nên dùng van có vòng ít nhất 100 ml). Phải đảm bảo độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của tín hiệu tích phân đối với việc bơm nhiều lần (n = 10) dung dịch chuẩn aflatoxin B₁ (nồng độ tương đương với mức nhiễm bẩn 1 mg/kg) cho giá trị tối đa là 10 %. Các dữ liệu này phải được ghi lại.

5.10. Cột RP-HPLC, ví dụ LC-18 hoặc ODS-2 là tùy chọn, nhưng nên dùng tiền cột.

5.11. Hệ thống dẫn xuất sau cột có PBPB (thay thế cho 5.12), bao gồm:

- bơm không xung thứ cấp dùng cho HPLC,

- chi tiết T thể tích chết zero và

- ống phản ứng PTFE có đường kính trong tối thiểu 0,5 mm x 45 cm.

Thời gian phản ứng phải ít nhất là 4 s trước khi phát hiện.

...

...

...

Thiết bị này cần được cài đặt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Để khẳng định hàm lượng aflatoxin B₁, cột HPLC phải được tháo ra khỏi dụng cụ brom hóa và phải được nối trực tiếp với detector huỳnh quang.

Không nên ngắt dòng điện khi các dụng cụ brom hóa vẫn đang hoạt động vì có khả năng brom vẫn còn trong màng cuvet của thiết bị.

5.13. Detector huỳnh quang, có bộ lọc bước sóng kích thích 360 nm và bộ lọc phát xạ ngừng hoạt động ở bước sóng lớn hơn 420 nm, hoặc loại tương đương.

Nếu cài đặt các detector có thể điều chỉnh được là Ex = 365 nm, Em = 435 nm, BW = 18 nm.

5.14. Bộ lọc dùng một lần (0,45 mm), trước khi dùng cần chắc chắn rằng không thất thoát aflatoxin trong quá trình lọc (phép thử thu hồi) vì có thể các vật liệu lọc khác nhau có thể giữ lại aflatoxin B_1.

5.15. pipet một vạch, dung tích 1 ml, 2 ml, 5 ml và 10 ml.

5.16. Cân phân tích, có khả năng cân chính xác đến 0,1 mg.

5.17. Cân phòng thử nghiệm, có khả năng cân chính xác đến 0,01 g.

5.18. Xyranh microlit hoặc pipet microlit đã hiệu chuẩn, dung tích 20 ml đến 500 ml.

...

...

...

5.20. Máy đo quang phổ.

5.21. Cuvet thủy tinh thạch anh, chiều dài đường quang 1 cm.

6. Cách tiến hành

6.1. Bảo ôn IAC

IAC (4.11) phải ở nhiệt độ phòng trước khi bảo ôn. Bảo ôn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nếu không quy định, thì cho 10 ml PBS (4.2) lên đỉnh IAC và cho đi qua IAC (theo trọng lực) với tốc độ 2 ml/min đến 3 ml/min. Đảm bảo rằng một phần nhỏ (0,5 ml) PBS vẫn còn trên IAC cho đến khi nạp dung dịch mẫu.

6.2. Chiết

Cân khoảng 50 g phần mẫu thử, chính xác đến 0,1 g cho vào bình nón 500 ml có nắp vặn hoặc nắp thủy tinh. Thêm 250 ml dung môi chiết axeton/nước (4.9). Đầu tiên lắc mạnh 15 s đến 30 s bằng tay, sau đó lắc 30 min bằng máy lắc (5.1). Lọc dịch chiết bằng giấy lọc gấp nếp (5.2). Dùng pipet (5.15) lấy 5,0 ml dịch lọc trong cho vào bình định mức 100 ml (5.7) và pha loãng đến vạch bằng PBS hoặc nước. Dung môi pha loãng (PBS hoặc nước) phải được chọn theo quy định của nhà sản xuất IAC. Nếu không quy định, thì dùng dung môi pha loãng PBS. Nếu dung dịch không trong, thì lọc lại qua bộ lọc bằng sợi thủy tinh (5.4) và cho chính xác 50 ml dịch lọc trong bình chứa vào IAC đã bảo ôn. (Nếu dung dịch đã trong, thì dung dịch pha loãng này có thể đưa trực tiếp lên IAC). Đưa dung dịch lên IAC như mô tả trong 6.3.1.

6.3. Làm sạch bằng ái lực miễn dịch

6.3.1. Yêu cầu  chung

...

...

...

Cho dịch lọc đi qua IAC với tốc độ dòng khoảng 1 giọt mỗi giây (khoảng 3 ml/min) (bằng trọng lực). Tốc độ dòng không được quá 5 ml/min. Rửa IAC với khoảng 20 ml nước (4.8), nạp hai phần mẫu thử, mỗi phần khoảng 10 ml ở tốc độ dòng 3 ml/min. Làm khô từ 5 s đến 10 s trong điều kiện chân không nhẹ hoặc cho dòng khí đi qua IAC trong 10 s bằng xyranh.

Rửa giải aflatoxin B₁, theo quy trình hai bước:

a) Nạp 0,50 ml metanol lên IAC và để cho aflatoxin B₁ đi qua IAC bằng trọng lực. Thu lấy dịch rửa giải vào bình định mức 5 ml (5.7).

b) Đợi 1 min rồi nạp phần 1,25 ml metanol thứ hai. Thu lấy phần lớn dung môi rửa giải bằng cách nén không khí, sau khi hầu hết dịch rửa giải đã đi qua IAC bằng trọng lực.

6.3.2. Phương án tùy chọn A (nên dùng)

CHÚ THÍCH Nên dùng phương án này, nhưng cần có detector huỳnh quang và hệ thống bơm thích hợp (xem thêm 5.9) Phương án tùy chọn B chỉ áp dụng nếu tín hiệu detector không đủ lớn để phân tích theo phương án tùy chọn A.

Thu lấy dịch rửa giải vào bình định mức 5 ml (5.7). Làm đầy bằng nước và lắc kỹ (thể tích cuối cùng theo 6.6). Nếu dung dịch trong, thì có thể dùng trực tiếp để phân tích HPLC. Nếu dung dịch không trong, thì lọc dung dịch qua giấy lọc dùng một lần (cỡ lỗ 0,45 mm) (5.14) trước khi bơm vào HPLC. Dùng vòng bơm mẫu để đảm bảo độ chính xác tối đa. Tùy thuộc vào hệ thống bơm, (Ví dụ xyranh hoặc bộ lấy mẫu tự động) mà lấy thể tích mẫu gấp ba lần cỡ vòng bơm và bơm ít nhất hai phần ba thể tích này vào van, để đảm bảo rằng phân đoạn giữa vẫn còn trong vùng bơm. Như vậy, vòng được tráng rửa bằng dung môi bơm trong khi dung môi trong van còn lại vẫn đủ.

6.3.3. Phương án tùy chọn B (chỉ áp dụng nếu có thể)

Nếu tín hiệu detector không đủ để đảm bảo độ lệch chuẩn tương đối (xem 5.9) được yêu cầu, thì có thể gồm có thêm bước làm bay hơi để thỏa mãn độ lệch chuẩn tương đối được yêu cầu.

...

...

...

6.4. Tạo dẫn xuất sau cột

Khi dùng PBPB, gắn chi tiết T vào ống phản ứng (xem 5.11) và sau đó vận hành với các thông số sau đây:

a) tốc độ dòng:

- 1,00 ml/min (pha động 4.12);

- 0,30 ml/min (thuốc thử 4.14).

Khi sử dụng điện hóa tạo brom, theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cài đặt cuvet và vận hành các thông số sau đây:

a) Tốc độ dòng:

- 1,00 ml/min (pha động 4.13);

b) dòng điện:

...

...

...

6.5. Dựng đường chuẩn

Để tính hồi quy tuyến tính, dùng phương pháp tính khoa học hoặc chương trình thống kê.

Chuẩn bị đường chuẩn bằng cách dùng dung dịch chuẩn làm việc trong 4.17. Các dung dịch này phải bao trùm trong dải aflatoxin B₁ từ 0,5 mg/kg đến 5,5 mg/kg. Dựng đường chuẩn trước để phân tích theo Bảng 1 và kiểm tra đường tuyến tính. Nếu hàm lượng aflatoxin B₁ trong mẫu nằm ngoài dải hiệu chuẩn, thì đường chuẩn phải được chuẩn bị một cách thích hợp. Cách khác, dung dịch bơm dùng để phân tích HPLC có thể được pha loãng đến hàm lượng thích hợp của aflatoxin B₁ để thiết lập được đường chuẩn.

6.6. Tính toán

Vẽ các tín hiệu theo trục x (chiều cao hoặc diện tích) với nồng độ của aflatoxin B_1­ (ng/ml) theo trục y. Xác định đường chuẩn từ dữ liệu này bằng cách sử dụng hồi quy tuyến tính. Dùng hàm kết quả để tính nồng độ aflatoxin B₁ trong dung dịch đã đo (ng/ml) từ mẫu thử:

y = ax + b

Từ đường chuẩn (hàm số), tính nồng độ aflatoxin của các dung dịch bơm thu được bằng hồi quy tuyến tính.

p = a x A + b

...

...

...

m là khối lượng mẫu được lấy để phân tích, tính bằng gam (50 g);

V_s là thể tích dung môi được lấy để chiết, tính bằng mililit (250 ml);

V_ext là thể tích pha nước được lấy từ dịch chiết, tính bằng mililit (5 ml);

V_D là thể tích đạt được sau khi pha loãng bằng PBS (nước), tính bằng mililit (100 ml);

V_clean là thể tích của pha loãng được lấy để là sạch miễn dịch, tính bằng mililit (50 ml);

V_E là thể tích cuối cùng đạt được sau khi rửa giải từ IAC, tính bằng mililit;

r là nồng độ aflatoxin được tính từ hồi quy tuyến tính, tính bằng nanogam trên millilit (ml);

w_c là phần mẫu có nhiễm aflatoxin B₁, tính bằng microgam trên kilogam;

A là diện tích hoặc chiều cao pic aflatoxin thu được từ các dung dịch đo.

...

...

...

6.7. Quy trình thêm chuẩn (spiking) để xác định độ thu hồi

Đối với phép xác định độ thu hồi, quy trình thêm chuẩn phải được thực hiện bằng cách sử dụng dung dịch gốc aflatoxin B₁ trong metanol. Mức thêm chuẩn phải nằm trong dải hiệu chuẩn (tốt nhất là lấy giá trị trung bình). Lấy cẩn thận không quá 2 ml dung môi thêm chuẩn (dung dịch phải đủ nồng độ aflatoxin B₁) và sau đó làm bay hơi ở nơi tối và nên kéo dài từ 0,5 h đến 2 h.

7. Độ chụm

7.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của phép thử nghiên cứu liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và các chất nền đã nêu.

7.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r:

-= 1,33 mg/kg r = 0,22 mg/kg (bổ sung chuẩn);

-= 3,89 mg/kg r = 0,69 mg/kg (bổ sung chuẩn);

...

...

...

-= 0,87 mg/kg r = 0,21 mg/kg (nhiễm tự nhiên);

-= 4,19 mg/kg r = 0,72 mg/kg (nhiễm tự nhiên);

7.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do hai phòng thử nghiệm khác nhau thực hiện, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R:

-= 1,33 mg/kg R = 0,72 mg/kg (bổ sung chuẩn);

-= 3,89 mg/kg R = 1,87 mg/kg (bổ sung chuẩn);

-= 0,54 mg/kg  R = 0,27 mg/kg (nhiễm tự nhiên);

-= 0,87 mg/kg  R = 0,47 mg/kg (nhiễm tự nhiên);

-= 4,19 mg/kg  R = 2,30 mg/kg (nhiễm tự nhiên);

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải chứa ít nhất các dữ liệu sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu;

b) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về chất hiệu chuẩn;

c) kết quả thử nghiệm và các đơn vị mà kết quả biểu thị;

d) ngày thử nghiệm;

e) các điểm cụ thể quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

f) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

PHỤ LỤC A

...

...

...

CÁC KẾT QUẢ CỦA PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

Phép thử cộng tác quốc tế gồm 21 phòng thử nghiệm ở 14 quốc gia đã thực hiện trên 5 mẫu thức ăn hỗn hợp cho trâu bò bao gồm các thành phần sau đây với số lượng giảm dần: gluten ngô, vỏ đậu tương, hạt ngũ cốc (lúa mì, lúa mạch, lúa mạch đen), chiết xuất mía đường và củ cải đường, cùi chanh, chiết xuất hoa hướng dương, đậu nành, ngô, cỏ, rỉ đường, canxi clorua, natri clorua, premix vitamin và premix vi khoáng. Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách trộn các thành phần thức ăn chăn nuôi ở trên (không kể lúa mì và ngô) với lúa mì và ngô chứa aflatoxin B₁ khoảng 0,15 mg/kg.

Phép thử do Trung tâm nghiên cứu phối hợp với Viện nghiên cứu vật liệu chuẩn và Đo lường, Geel, Bỉ, công nhận vào năm 1999 (xem tài liệu tham khảo [5]), các kết quả thu được phân tích thống kê theo quy tắc đã hài hòa của Hiệp hội hóa học thuần túy và ứng dụng quốc tế (IUPAC).

Bảng A.1 - Dữ liệu về độ chụm

Mẫu trắng

Mẫu thêm chuẩn có aflatoxin B₁

mg/kg

Chất nhiễm tự nhiên có aflatoxin B₁

...

...

...

1,2^a

3,6^a

0,5^b

1,0^b

5^b

Số lượng các phòng thử nghiệm tham gia

21

21

21

...

...

...

21

21

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi đã loại trừ ngoại lệ

0

1

1

3

2

3

...

...

...

21

20

20

18

19

18

Giá trị trung bình, , mg/kg

< 0,02

1,33

...

...

...

0,54

0,87

4,19

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/g

0,08

0,25

0.04

0,08

...

...

...

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, %

5,9

6,4

7,2

8,7

6,2

Giới hạn lặp lại r(=2,8 s_r), mg/g

...

...

...

0,69

0,11

0,21

0,72

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/g

0,26

0,67

0,10

...

...

...

0,82

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, %

19,4

17,5

17,9

19,4

19,6

Giới hạn tái lập R (=2,8 x S_R), mg/g

...

...

...

0,72

1,87

0,27

0,47

2,30

Giá trị Horrat^c

0,45

0,47

...

...

...

0,4

0,54

Độ thu hồi

110,8

108,1

n.a

n.a

n.a

...

...

...

^b Các mức này là mức mục tiêu (tốt nhất ước tính) trong quá trình tạo mẫu để thử nghiệm.

^c Do các giá trị này thấp hơn 1,5, vì vậy không thực sự ảnh hưởng đến việc áp dụng hoặc hiệu lực của phương pháp.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] WERNER, G., Bestimmung der Aflatoxine in Futtermitteln nach selektiver Reinigung an einer Immunoaffinitaetssaeule. Agribiological Research, 44 (4), 1991, pp.289-298

[2] Laboratory decontamination and destruction of aflatoxins B₁, B₂, G₁ and G₂ in laboratory wastes. CASTEGNARO, M., HUNT, D.C., SANSONE, Ε.B., SCHULLER, Ρ.L. SIRIWARDANA, M.G., TELLING, G.M., van EGMOND, H.P. and WALKER, Ε.A. IARC Scientific publication No. 37, International Agency for Research on Cancer (WHO), Lyon (Frane), 1980, ρ. 59.

[3] Laboratory decontamination and destruction of carcinogens in laboratory-wastes: some mycotoxins. CASTEGNARO, M., BAREK, J., FREMY, J.M., LAFONTAINE, M. MIRAGLIA, M., SANSONE, Ε.B. and TELLING, G.M. IARC Scientific publication No. 113, International Agency for Research on Cancer (WHO), Lyon (Frane), 1991, p. 63

[4] Methodenbuch Band III, Erg. 1997, Sec. 16.1.4. VDLUFA-Verlag Darmstadt, Germany

[5] STROKA, J., REUTTER, M., VON HOLST, C. and ANKLAM, Ε. Immunoaffinity colum clean-up with liquid chromatography using post-colum bromination for the determination of aflatoxin B₁ in cattle feed. JAOAC, 86 (6), 2003, pp. 1179-1186

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9126:2011 (ISO 17375:2006) về Thức ăn chăn nuôi – Xác định aflatoxin B1