Cặp mồi trên dùng để khuếch đại đoạn DNA của KHV có kích thước 409 bp.

Chuẩn bị mồi:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µl làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µl: pha loãng mồi gốc bằng nước không có nuclease (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).

3.2.5.2.2. Chuẩn bị phản ứng

Tùy theo điều kiện phòng thử nghiệm, chọn lựa hỗn hợp Mix phản ứng cho phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong 1 ống Eppendorf dựa trên tổng số mẫu cần chẩn đoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm. Sau đó hút 22,5 µl hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf 0,2 ml; ghi ký hiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.

3.2.5.2.3. Tiến hành phản ứng PCR vòng ngoài (bước 1)

Thêm 2,5 µl DNA mạch khuôn (tách chiết được) vào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứng PCR (thành phần gồm: KCl 50 mM; Tris-HCl 10 mM, pH 9; Triton X-100 0,1 %; mỗi dNTP nồng độ 0,2 mM; MgCl₂ 1,5 mM; mỗi mồi xuôi và mồi ngược có nồng độ 1 µM; 1,25 U of Taq DNA polymerase và nước cho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 µl.

...

...

...

Ví dụ về hỗn hợp phản ứng PCR sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X như trong Bảng 2.

Bảng 2 – Hỗn hợp phản ứng PCR

Thành phần

Thể tích cho một mẫu, µl

Nồng độ cuối cùng

Promega Gotag Green Master Mix, 2X

12,5

1 X

Mồi xuôi

...

...

...

1 µM

Mồi ngược

1,25 (20 µM)

1 µM

DNA mạch khuôn

2,5

Nước

7,5

...

...

...

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Bước

Nhiệt độ/thời gian

Số chu kỳ

94 °C/5 min

1

...

...

...

95 °C/1 min

40

Bắt cặp

55 °C/1 min

Kéo dài mạch

72 °C/1 min

Kéo dài mạch

72 °C/10 min

1

...

...

...

4 °C

Giữ ổn định

CHÚ Ý: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

3.2.5.3. Chạy điện di

3.2.5.3.1. Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.

Sau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì cho vào 5 µl etidi bromua/100 ml. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để etidi bromua tan đều.

Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khôn, rồi đổ thạch vào khuôn.

Tiến hành đổ vào bản gel, không nên đổ bản gel dày quá 0,8 cm.

...

...

...

Chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel.

3.2.5.3.2. Điện di

Hút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào một giếng trên bản gel.

Khi thực hiện điện di, chạy kèm theo thang trọng lượng phân tử chuẩn để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang DNA vào một giếng trên bản gel.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V đến 150 V, trong thời gian 35 min đến 40 min.

CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di nhỏ 2 µl đệm tải mẫu 6X lên giấy parafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra, nhỏ vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10 µl nhỏ vào một giếng trên bản gel.

3.2.5.4. Đọc kết quả

Sau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết quả với tia UV ở bước sóng 302 nm.

Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang DNA, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm để đưa ra kết luận.

...

...

...

Giếng

Vạch 409 bp

Kết quả

Thang DNA

Phân vạch rõ ràng và sáng theo kích thước sử dụng

Điện di tốt

Mẫu đối chứng dương tính

Có

Hỗn hợp phản ứng PCR tốt

...

...

...

Mẫu đối chứng dương tính hỏng, enzym hỏng

Mẫu đối chứng âm tính

Không

Không ngoại nhiễm

Có

Bị ngoại nhiễm

Mẫu

Có

Dương tính với KHV

...

...

...

Âm tính với KHV

Kết quả mẫu thử dương tính khi xuất hiện vạch sáng có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 409 bp, thang DNA phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm không có vạch sáng.

Kết quả mẫu thử âm tính khi mẫu không có vạch sáng kích thước 409 bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, thang DNA phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng dương có vạch sáng 409 bp.

4. Báo cáo kết quả chẩn đoán

Mẫu được xác định nhiễm bệnh do KHV khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng của bệnh và kết quả phản ứng PCR phát hiện vi rút dương tính.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bercovier H., Fishman Y., Nahary R., Sinai S., Zlotkin A., Eyngor M., Gilad O., Eldar A. & Hedrick R.P. 2005. Cloning of the koi herpesvirus (KHV) gene encoding thymidine kinase and its use for a highly sensitive PCR based diagnosis. BMC Microbiol., 5, 1-9.

[2] Bùi Quang Tề. 2008. Bệnh học thủy sản.

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-6:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 6: Bệnh do Koi Herpesvirus ở cá chép