Điều chỉnh đến đến pH = 6 - 8 trong các bình, đặt cả ba bình đã được nút bằng bông lên một máy lắc có khả năng thông khí và khuấy trộn tạo điều kiện môi trường tốt cho nuôi cấy chuyển. Duy trì nhiệt độ ở 25 ± 30C. Thời gian cấy chuyển trong 72 giờ.

3.6.2.2 Sau 72 giờ lắc trên, lặp lại như quá trình 3.6.2.1 trong ba bình dung tích 1000 ml khác, có các thành phần như sau:

Bình mẫu trắng

Bình mẫu đối chứng

Bình mẫu thử

Môi trường cơ bản, ml

500

500

...

...

...

Chất hoạt động bề mặt, dung dịch tiêu chuẩn, mg/l

0

30

0

Chất hoạt động bề mặt, dung dịch mẫu thử lấy từ mục 3.7, mg/l

0

0

30

Dung dịch lấy từ mục 3.6.2.1, ml

...

...

...

5

5

Điều chỉnh đến pH = 6 - 8 trong các bình, đặt cả ba bình đã được nút bằng bông lên một máy lắc có khả năng thông khí và khuấy trộn tạo điều kiện môi trường tốt cho nuôi cấy chuyển. Duy trì nhiệt độ ở 25 ±3 0C. Thời gian cấy chuyển trong 72 giờ. Dung dịch 3.6.2.2 này dùng để phân huỷ mẫu thử.

3.7 Tách chất hoạt động bề mặt từ sản phẩm chất tẩy rửa tổng hợp

Cân khoảng 50 g mẫu (chính xác đến 0,1 g) vào cốc thuỷ tinh dung tích 500 ml, thêm vào đó 40 ml etanol. Cô mẫu trên bếp cách thuỷ đến khô sau hoà tan mẫu bằng 300 ml etanol, đậy cốc bằng mặt kính đồng hồ, đun nóng trên bếp cách thuỷ và khuấy cho mẫu phân tán hoàn toàn. Lọc mẫu qua giấy lọc vào cốc dung tích 250 ml đã được sấy khô và cân trước đến khối lượng không đổi m0 (chính xác đến 0,1 g). Cô nhẹ cốc trên bếp cách thuỷ đến còn khoảng 50 ml.

Tiếp tục quá trình hoà tan trên hai lần nữa, mỗi lần với 200 ml etanol. Thu gộp tất cả dung dịch lọc vào cốc đang cô trên và cô nhẹ tiếp cốc này trên bếp cách thuỷ cho đến khi chỉ còn lại cặn. Sấy cốc này ở nhiệt độ 105 0C đến khối lượng không đổi. Để nguội cốc trong bình hút ẩm, sau 30 phút đem cân là giá trị m1 (chính xác đến 0,1 g).

 Hoà tan 1,00 g chất hoạt động bề mặt ở phần cặn trong bình định mức dung tích 1000 ml. Dung dịch này dùng để xác định độ phân huỷ sinh học chất hoạt động bề mặt trong mẫu thử.

3.8 Quá trình phân huỷ sinh học của chất hoạt động bề mặt

Chuẩn bị ba bình nuôi cấy, dung tích 1000 ml, có các thành phần như sau:

...

...

...

Bình mẫu trắng

Bình mẫu đối chứng

Bình mẫu thử

Môi trường cơ bản, ml

500

500

500

Chất hoạt động bề mặt, dung dịch tiêu chuẩn, mg/l

...

...

...

30

0

Chất hoạt động bề mặt, dung dịch mẫu thử lấy từ mục 3.7, mg/l

0

0

30

Dung dịch lấy từ mục 3.6.2.2, ml

5

5

...

...

...

Điều chỉnh đến pH = 6 - 8 trong các bình, đặt cả ba bình đã được nút bằng bông lên một máy lắc có khả năng thông khí và khuấy trộn tạo điều kiện môi trường tốt cho nuôi cấy chuyển. Duy trì nhiệt độ ở 25  30C. Thời gian nuôi và phân huỷ chất hoạt động bề mặt trong vòng 8 ngày.

3.9 Phương pháp xác định

Để thu được kết quả phân huỷ sinh học, lấy một phần mẫu chất hoạt động bề mặt ở phần 3.8 từ ba bình trước khi phân huỷ sinh học và sau 8 ngày phân huỷ sinh học đem xác định. Thể tích mẫu xác định, mẫu đối chứng và mẫu trắng phải giống nhau.

3.9.1 Mẫu chứa chất hoạt động bề mặt anion

3.9.1.1 Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên đo độ hấp thụ mầu của phức chất hoạt động bề mặt anion với methylen xanh trong pha clorofoc ở bước sóng 1 = 650 nm .

3.9.1.2 Hoá chất và thuốc thử:

– dung dịch đệm borac pH = 10: trộn 0,05 M natri tetraborac với 0,1 M NaOH theo tỉ lệ (1 : 1);

– axit sunfuric, 0,5 M;

– methylen xanh, dung dịch 0,25 % pha trong nước;

...

...

...

+ dung dịch A (1 mg/ml): Hoà tan 1,00 g natri lauryl sunphat vào bình định mức dung tích 1000 ml bằng nước, định mức tới vạch và lắc kỹ.

+ dung dịch B (0,01 mg/ml): Hút 10,0 ml dung dịch A vào bình định mức dung tích 1000 ml, định mức tới vạch bằng nước và lắc kỹ.

3.9.1.3 Thiết bị và dụng cụ:

– máy so mầu, bước sóng  = 650 nm;

– cuvet 10 mm, 50 mm;

– phễu chiết, dung tích 250 ml, 2000 ml;

– bình định mức, dung tích 50 ml.

3.9.1.4 Làm sạch các dung dịch

Cho 500 ml nước, 100 ml đệm borax và 50 ml dung dịch methylen xanh vào phễu chiết A dung tích 2000 ml.

...

...

...

Đồng thời cả hai phễu đều được chiết với 100 ml clorofoc trong vòng một phút để rửa pha nước, sau đó loại bỏ pha clorofoc. Lặp lại quá trình rửa pha nước này bằng cách chiết tiếp hai lần nữa, mỗi lần với 30 ml clorofoc và loại bỏ pha clorofoc.

Cho vào phễu chiết B 30 ml axit sunfuric 0,5 M.

Các dung dịch ở phễu chiết A và B được chuyển dần vào các phễu chiết nhỏ a, b dung tích 250ml.

3.9.1.5 Dựng đường chuẩn

Cho lần lượt 0; 0,010; 0,020; 0,040; 0,060; 0,080; 0,10; 0,12; 0,15 mg chất hoạt động bề mặt natri lauryl sunfat vào phễu chiết a đã có sẵn 50 ml dung dịch lấy từ phễu A và thêm vào đó 15 ml clorofoc. Lắc phễu trong vòng một phút với tốc độ hai lần lắc trong một giây, để yên phễu cho đến khi phân lớp, chuyển pha clorofoc sang phễu b đã có sẵn 100 ml dung dịch lấy từ phễu B rồi lắc trong vòng một phút, sau khi phân lớp chuyển pha clorofoc qua phễu lọc có lớp bông đã tẩm trước bằng clorofoc vào bình định mức dung tích 50 ml.

Cho thêm vào phễu a 15 ml clorofoc và tiếp tục chiết như trên và chuyển pha clorofoc gộp vào bình định mức trên. Định mức tới vạch bằng clorofoc, lắc kỹ. Đo mầu của dung dịch trong vòng ba giờ, ở bước sóng 1 = 650 nm, bằng cuvet 10 mm, dung dịch so sánh là clorofoc. Dựng đường chuẩn.

3.9.1.6 Đo màu

Lấy một phần mẫu thử trong từng bình ở điều 3.8 trước và sau 8 ngày phân huỷ sinh học, sao cho mẫu có khoảng từ 0,02 - 0,1 mg chất hoạt động bề mặt anion vào phễu chiết a đã có sẵn 50 ml dung dịch lấy từ phễu A và thêm vào đó 15 ml clorofoc. Lắc phễu trong vòng một phút với tốc độ hai lần lắc trong một giây, để yên phễu cho đến khi phân lớp, chuyển pha clorofoc sang phễu b đã có sẵn 100 ml dung dịch lấy từ phễu B rồi lắc trong vòng một phút, sau khi phân lớp chuyển pha clorofoc qua phễu lọc có lớp bông đã tẩm trước bằng clorofoc vào bình định mức dung tích 50 ml.

Cho thêm vào phễu a 15 ml clorofoc và tiếp tục chiết như trên và chuyển pha clorofoc gộp vào bình định mức trên. Định mức tới vạch bằng clorofoc, lắc kỹ. Đo mầu của dung dịch trong vòng ba giờ, ở bước sóng 1 = 650 nm, bằng cuvet 10 mm, dung dịch so sánh là clorofoc.

...

...

...

Từ đường chuẩn và số đo độ hấp thụ của mẫu tính được hàm lượng chất hoạt động bề mặt anion có trước và sau 8 ngày phân huỷ sinh học.

3.9.1.6 Trong trường hợp chất hoạt động bề mặt anion không đo ngay có thể thêm 1 ml formalin trong 100 ml dung dịch mẫu.

3.9.2 Mẫu chứa chất hoạt động bề mặt không ion

3.9.2.1 Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên đo độ hấp thụ của phức chất hoạt động bề mặt không ion với coban amonithiocyanat trong pha benzen ở bước sóng 1 = 322 nm.

3.9.2.2 Hoá chất và thuốc thử:

– natri clorua, tinh thể;

– coban amonithiocyanat: Hoà tan 620 g amonithiocyanat và 280 g coban nitrat ngậm sáu phân tử nước trong 1000 ml nước;

– benzen;

– dung dịch tiêu chuẩn chất hoạt động bề mặt không ion:

...

...

...

+ dung dịch B 0,01 mg/ml: Hút 10,0 ml dung dịch A vào bình định mức dung tích 1000 ml, định mức tới vạch bằng nước và lắc kỹ.

 3.9.2.3 Thiết bị và dụng cụ:

– máy so mầu;

– cuvet thạch anh 10 mm, 50 mm;

– phễu chiết, dung tích 300 ml;

– bình định mức, dung tích 25 ml.

3.9.2.4 Dựng đường chuẩn

Lần lượt cho vào phễu chiết 0; 0,25; 0,50; 1,00; 1,50; 2,00; 2,50; 3,00; 4,00 mg chất hoạt động bề mặt không ion, thêm nước đến thể tích 100 ml. Cho vào phễu 15 ml dung dịch coban amonithiocyanat, 35 g natri clorua và lắc trong một phút, để phễu đứng yên khoảng 15 phút rồi hút chính xác 25 ml benzen và tiếp tục lắc trong một phút nữa. Sau khi phân lớp, loại bỏ pha nước và chuyển pha benzen vào bình định mức qua lớp bông thuỷ tinh. Chú ý không thêm benzen tới vạch bình định mức. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng hấp thụ cực đại  = 322 nm trong cuvet thạch anh 10 mm , dung dịch so sánh là benzen. Dựng đường chuẩn.

3.9.2.5 Đo màu:

...

...

...

Khi đo độ hấp thụ của mẫu nếu nhỏ hơn 0,1 thì sử dụng cuvet thạch anh 50 mm.

3.9.2.6 So sánh mẫu với đường chuẩn

Từ đường chuẩn và số đo độ hấp thụ của mẫu tính được hàm lượng chất hoạt động bề mặt không ion có trước khi phân phân huỷ sinh học và sau 8 ngày phân huỷ sinh học.

3.9.3 Phương pháp đo thể tích bọt bóng khí

Dùng cho chất hoạt động bề mặt không ion là amid của axit rượu béo.

3.9.3.1 Nguyên tắc

Mẫu chất hoạt động bề mặt amid của axit rượu béo trong ống thử được lắc trong một điều kiện nhất định, và được xác định bằng cách đo thể tích bong bóng sinh ra.

3.9.3.2 Thiết bị và dụng cụ:

– ống thử hình trụ bằng thuỷ tinh, có nút đậy, đường kính trong 2,5 cm, được chia vạch từ 0 ml đến 100 ml,

...

...

...

3.9.3.3 Dựng đường chuẩn

Lần lượt cho vào ống thử 0; 0,25; 0,50; 1,0; 1,5; 2,0 ; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 mg chất hoạt động bề mặt không ion, lần lượt thêm dung dịch ở bình mẫu trắng đến thể tích 50 ml, đậy nút và lắc đứng khoảng 50 lần với tốc độ 2 lần trong một giây, để đứng yên trong 30 giây, đo thể tích bong bóng sinh ra (ml). Đo hai lần để tính kết quả trung bình. Dựng đường chuẩn.

3.9.3.4 Cách tiến hành

Lấy 50 ml dung dịch mẫu thử , mẫu đối chứng và mẫu trắng ở điều 3.8 trước và sau khi phân huỷ
8 ngày vào ống thử, đậy nút và lắc đứng khoảng 50 lần với tốc độ 2 lần trong một giây, để đứng yên trong 30 giây, đo thể tích bong bóng sinh ra (ml). Đo hai lần để tính kết quả trung bình, so sánh với đường chuẩn.

3.10 Tính kết quả

Độ phân huỷ sinh học tính sau 8 ngày (D) được thể hiện bằng phần trăm khối lượng (%) và được tính theo công thức sau:

trong đó,

...

...

...

đầu thử phân huỷ sinh học, tính bằng mg/l chất hoạt động bề mặt;

 T0 là giá trị trung bình của các số liệu phân tích ở bình mẫu trắng bắt đầu phân huỷ sinh học, tính bằng mg/l chất hoạt động bề mặt.

 S8 là giá trị trung bình của các số liệu phân tích bình mẫu thử, bình mẫu đối chứng sau 8 ngày phân huỷ sinh học, tính bằng mg/l chất hoạt động bề mặt.

T8 là giá trị trung bình của các số liệu phân tích ở bình mẫu trắng sau 8 ngày phân huỷ sinh học, tính bằng mg/l chất hoạt động bề mặt.

Các phép đo lấy từ dung dịch ở 3.8, theo các phép đo ở 3.9

3.11 Khảng định kết quả thử

Trong trường hợp độ phân huỷ sinh học của các chất hoạt động bề mặt trong bình mẫu đối chứng nhỏ hơn 95% , thì kết quả phân huỷ trên sẽ không có giá trị.

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6969:2001 về phương pháp thử độ phân hủy sinh học của chất tẩy rửa tổng hợp do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành