7. Tiến hành thử nghiệm

7.1. Chiết mẫu và làm sạch mẫu

Thêm 4 ml nước (3.19) và 0,5 ml HCI 1N (3.21), 100 ml 2-nitrobenzaldehyt (3.23) vào từng lọ mẫu. Lắc trong 1 min (4.4), ủ 60 °C trong 3h (4.9) hoặc ở 37 °C trong 16 h.

Thêm 0,5 ml K₂HPO₄ 1N (3.25), 0,2 ml NaOH 2N (3.22); Lắc trong 30 giây (4.4);

Thêm 5 ml ethyl acetate (3.13); Lắc trong 1 min (4.4). Sau đó lắc 300 r / min trong 30 min bằng máy lắc ngang (4.3).

Ly tâm mẫu tại 3000 r / min trong 5 min (4.2); Hút hết lớp trên vào ống nghiệm (4.7).

Tiếp tục thêm 5ml ethylacetate (3.13); Lắc trong 1 min (4.4). Sau đó lắc 300 r / min trong 10 min bằng máy lắc ngang (4.3);

Ly tâm mẫu tại 3000 r / min trong 5 min (4.2); Hút lớp trên gộp vào ống nghiệm trên (4.7). Sau đó thổi khô dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ 50 °C (4.10).

Hòa tan phần cặn bằng 1 ml n-hexan (3.17), 1 ml amonium acetate 4% (3.24); Lắc trong 30 giây (4.4); Ly tâm mẫu tại 3000 r / min trong 5 min (4.2). Hút lớp dưới, sau đó làm sạch mẫu bằng cách qua cột chiết pha rắn.

...

...

...

Rửa cột bằng 1 ml nước (3.19), đợi cho nước chảy hết sau đó để khô trong 5 min bằng bơm hút chân không.

Giải hấp bằng 1 ml ethylacetate (3.13), sau đó thổi khô dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ 50 °C (4.10). Hòa tan phần cặn bằng 250 mL (3.33). Lắc trong 30 giây (4.4), sau đó đưa vào lọ đựng mẫu (4.13).

7.2. Tiến hành thử nghiệm trên LC-MS-MS

7.2.1. Điều kiện HPLC

- Cột sắc ký RP C18, đường kính trong là 2,1 cm, kích thước hạt nhồi là 1,7 mm, độ dài của cột là 50 mm;

- Nhiệt độ cột theo nhiệt độ phòng;

- Thể tích bơm mẫu: 10 mL;

- Thời gian phân tích: 4 min;

- Tốc độ dòng toàn phần: 0,4 ml / min;

...

...

...

Bảng 2 - Chương trình pha động

Thời gian

(min)

A%

(Methanol LC/MS)

B%

(Dung dịch ammonium formate 1 mM)

0

55

...

...

...

2,0

55

45

2,1

90

10

3,5

90

10

...

...

...

55

45

7.2.2. Điều kiện trên MS

Điều kiện trên MS như sau:

Kiểu ion hóa: ESI (+);

Nhiệt độ nguồn ion hóa: 150 °C;

Nhiệt độ hóa hơi dung môi: 400 °C;

Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi: 600 I / h;

Tốc độ dòng khí qua khối nón: 30 I / h;

...

...

...

Bảng 3 - Điều kiện phân ly MS/MS

Thành phần

lon sơ cấp (m/z)

lon thứ cấp (m/z)

Năng lượng mặt nón (V)

Năng lượng va chạm (eV)

NPAMOZ

335

262

...

...

...

24

24

16

11

NPAMOZ-d₅

400

296

24

11

...

...

...

236

104 (*)

134

24

24

20

12

NPAOZ-d₄

240

...

...

...

24

20

NPSEM

209

166 (*)

192

20

20

9

...

...

...

NP IS-SEM

212

169

20

9

NPAHD

249

194

178 (*)

...

...

...

20

11

16

NP-AHD-d₂

251

180

20

16

GHI CHÚ: ion có kí hiệu (*) là ion dùng để định lượng;

...

...

...

7.3.1. Bơm dung môi kiểm tra máy, dung dịch hòa tan mẫu (3.27);

7.3.2. Bơm các dung dịch lập đường chuẩn;

7.3.3. Bơm mẫu trắng;

7.3.4. Bơm mẫu kiểm soát;

7.3.5. Bơm mẫu thử.

8. Tính toán và biểu thị kết quả

8.1. Tính hệ số tín hiệu

Tính cho từng chất cần phân tích theo phương trình:

Trong đó: RF: hệ số tín hiệu;

...

...

...

Sp_IS: diện tích pic của ion thứ cấp của chất chuẩn nội tương ứng.

8.2. Xây dựng đường chuẩn

Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn cho vào mẫu thực được chuẩn bị mẫu theo mục 6.4. Phương trình có dạng: RF = ax + b. Trong đó:

- RF: Hệ số tín hiệu, tính theo mục 8.1;

- x: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu, chuẩn bị theo mục 6.4;

- b: điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;

- a: hệ số góc của đường chuẩn.

Phương trình đạt yêu cầu khi hệ số hồi quy R²³0.99.

8.3. Hàm lượng chất phân tích trong mẫu

...

...

...

Trong đó:

C: là nồng độ chất phân tích có trong mẫu, tính bằng mg / kg;

C_x: là nồng độ chất phân tích đo được suy ra từ đường chuẩn, mg / l;

V: là thể tích định mức cuối cùng, tính bằng ml;

F: là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);

a: là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

8.4. Biểu thị kết quả

Kết quả được biểu thị bằng đơn vị mg / kg (ppb), hai số sau dấu phẩy.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm.

- Độ lập lại của phương pháp;

- Kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] Decision 2002/657/ CE.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9782:2013 về Thịt - Xác định dư lượng các chất chuyển hóa của nitrofuran (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS-MS