9.2.1.3. Tốc độ dòng

Cài đặt tốc độ dòng của dung môi rửa giải ở 1,2 ml/min.

9.2.1.4. Nhiệt độ cột

Nhiệt độ của cột phải được duy trì không đổi trong dải từ 30⁰C đến 35⁰C đối với cột "Furosin chuyên dụng", hoặc theo loại cột được sử dụng.

9.2.1.5. Cân bằng

Cân bằng hệ thống sắc ký bằng cách rửa cột trong vài phút bằng hỗn hợp dung môi A và B theo tỷ lệ 50:50 và tốc độ dòng 1,2 ml/min. Sau đó cài đặt lại điều kiện ban đầu (9.2.1.2) cho đến khi thu được đường nền ổn định.

9.2.1.6. Xác định

Thực hiện chạy mẫu trắng bằng cách bơm khoảng từ 20ml đến 50ml dung dịch axit clohydric III (5.4) nhằm kiểm tra độ tinh khiết của dung môi. Sau khi kết thúc công đoạn cân bằng, độ nhạy của detector phải ổn định ở giá trị ban đầu.

Cho chạy cả dịch thủy phân đã tinh sạch (9.1.3) và dung dịch chuẩn furosin (5.8) trên hệ thống sắc ký bằng cách bơm mỗi dung dịch khoảng 20ml đến 50 ml. Pic furosin phải hiện rõ trên đường nền có thời gian lưu trong khoảng từ 20 min đến 24 min.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Tín hiệu của furosin ở bước sóng 280 nm đã được chứng minh là tuyến tính trong dải bơm từ 1 pmol đến 1000 pmol, trong dải nồng độ nghiên cứu từ 5 pmol đến 500 pmol. Do đó, không cần thực hiện hiệu chuẩn nhiều điểm.

10. Tính và biểu thị kết quả

10.1. Tính kết quả

Tính hàm lượng furosin của mẫu thử, w, theo công thức sau:

Trong đó:

w  là hàm lượng furosin của mẫu, tính bằng miligam trên 100 g protein;

A_t là diện tích pic của furosin thu được đối với mẫu thử (9.2.1.6);

c  là lượng furosin chính xác trong thể tích dung dịch chuẩn (5.8) đã bơm vào cột (khoảng từ 20 ml đến 50 ml), tính bằng picomol.

...

...

...

V  là thể tích đã bơm, tính bằng microlit, (V trong khoảng từ 20ml đến 50ml);

d  là hệ số pha loãng đã dùng để chiết pha rắn (d = 6);

F là hệ số thu hồi của chiết pha rắn (F=0,95);

M là khối lượng phân tử của furosin (M = 254);

m là khối lượng của hàm lượng protein trong 2 ml dịch thủy phân (8.4), tính bằng miligam (mg).

10.2. Biểu thị kết quả

Kết quả được biểu thị đến một chữ số thập phân.

11. Độ chụm

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

...

...

...

11.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, sử dụng cùng thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn, không được quá 5% các trường hợp lớn hơn 6% giá trị trung bình của các kết quả.

11.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do hai người phân tích, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5% các trường hợp lớn hơn 15% giá trị trung bình của các kết quả.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

...

...

...

e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếp đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

CÁC VÍ DỤ VỀ SẮC ĐỒ HPLC

CHÚ DẪN:

X thời gian lưu, tính bằng phút

Y điện áp, tính bằng mili vôn

...

...

...

Hình A.1 - Mẫu sắc đồ HPLC của dung dịch chuẩn furosin (pic của furosin 53 pmol)

CHÚ DẪN: Theo chú dẫn trong Hình A.1.

Hình A.2 - Mẫu sắc đồ HPLC của sữa thanh trùng dương tính với peroxidase
(pic của furosin 8 pmol)

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

KẾT QUẢ CỦA PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

Các kết quả thu được đã được phân tích thống kê phù hợp với ISO 5725 4) để cho dữ liệu về độ chụm nêu trong Bảng B.1.

...

...

...

Bảng B.1 - Kết quả thử liên phòng thử nghiệm

Sữa thanh trùng A

Sữa thanh trùng B

Sữa thanh trùng HT A

Sữa thanh trùng HT B

Sữa tiệt trùng UHT A

Sữa tiệt trùng UHT B

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

...

...

...

8

8

8

8

8

Giá trị trung bình ^a

8,68

9,31

11,73

...

...

...

46,07

80,45

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r^a

0,18

0,17

0,24

0,43

0,83

1,46

...

...

...

0,51

0,48

0,66

1,21

2,33

4,08

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R^a

0,61

0,70

...

...

...

0,85

2,34

2,33

Giới hạn tái lập, R (= 2,8 s_R)^a

1,72

1,95

2,05

2,39

6,55

...

...

...

^a Các giá trị được  biểu thị bằng miligam furosin trên 100 g protein.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] RESMINI, P., Pellegrino, L. and BATTELLI, G. Accurate quantification of furosine in milk and dairy products by direct HPLC method, It. J. Food Sci., 3, 1990, pp. 173-183.

[5] RESMINI, P., PELLEGRINO, L, MASOTTI, F., TIRELLI, and PRATI, F, Determinazione del latte in polvere ricostituito nel latte crudo ed in quello pastorizzato, mediante HPLC della furosina. Sci. Teen, Latt-Cas., 43, 1992, pp. 169-186.

[6] RESMINI, P., PELLEGRINO, L. and MASOTTI, F. Evaluation of the Maillard reaction extent for quality control of low-heat treated dairy products. IDF Special Issue 9303, Protein and fat globule modifications by heat-treatment, homogenisation and other technological means for high quality dairy products, 1993, pp. 153-164.

...

...

...

2) Cột "Furosin chuyên dụng" được cung cấp bởi Alltech - Europe, Laarne, Đức.

3) Pyrex là ví dụ về sản phẩm có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

4) ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory test dùng để thu được dữ liệu về độ chụm. Tiêu chuẩn này đã hủy và được thay bằng bộ tiêu chuẩn ISO 5725 (gồm 6 phần) và đã được chấp nhận thành bộ TCVN 6910 (ISO 5725).

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9662:2013 (ISO 18329:2004) về Sữa và sản phẩm sữa - Xác định hàm lượng furosin - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo cặp ion