Việc chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn có thể được thực hiện bằng cách sử dụng pipet hoặc dụng cụ thủy tinh đã hiệu chuẩn sẵn có.

7.4 Đường chuẩn

Chuẩn bị đường chuẩn bằng cách bơm 1 000 μl các dung dịch hiệu chuẩn được nêu trong Bảng 1 vào hệ thống HPLC bắt đầu mỗi ngày phân tích. Vẽ diện tích pic dựa vào khối lượng của aflatoxin B₁ đã bơm và kiểm tra đường chuẩn về độ tuyến tính.

Chuẩn bị đường chuẩn thích hợp trong trường hợp hàm lượng aflatoxin B₁ trong mẫu nằm ngoài dải hiệu chuẩn. Cách khác, dung dịch bơm để phân tích HPLC có thể được pha loãng đến hàm lượng aflatoxin B₁ thích hợp cho đường chuẩn đã thiết lập.

7.5 Xác định aflatoxin B₁ trong dung dịch mẫu thử

Bơm phần dịch lỏng của dung dịch mẫu thử (6.3) vào hệ thống HPLC, sử dụng cùng một điều kiện như đã dùng đối với chuẩn bị đường chuẩn.

7.6 Khẳng định aflatoxin B₁

Để khẳng định aflatoxin B₁, tháo cột HPLC ra khỏi thiết bị brom hóa và nối HPLC trực tiếp với detector huỳnh quang. Tín hiệu aflatoxin B₁ giảm đáng kể (10 lần hoặc nhiều hơn) khi tháo hệ thống tạo dẫn xuất ra khỏi HPLC. Không ngắt dòng điện thiết bị brom hóa đang được kết nối vì brom có thể vẫn còn sót lại trong màng cuvet.

Cách khác: có thể áp dụng kỹ thuật nhận biết bằng đo khối phổ bằng cách tiến hành phân tích sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) hoặc sắc ký lỏng với khối phổ hai lần (LC-MS/MS).

...

...

...

Xác định nồng độ khối lượng aflatoxin B₁, biểu thị bằng nanogam trên mililit (ng/ml) trong dung dịch bơm từ đường chuẩn. Tính phần khối lượng, w_afla, của aflatoxin B₁ biểu thị bằng nanogam trên gam (ng/g), theo Công thức (2):

                                         (2)

Trong đó:

ρ_afla        là nồng độ của aflatoxin B₁ trong dung dịch thử đã được bơm và thu được từ đường chuẩn, tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml);

V₁         là thể tích của dung môi đã lấy để chiết (ở đây là 250 ml), tính bằng mililit (ml);

V₂         là thể tích của dịch chiết mẫu chưa pha loãng được lấy để làm sạch trên cột ái lực miễn nhiễm (trong trường hợp này là 5 ml đến 10 ml), tính bằng mililit (ml);

V₃         là thể tích thu được sau rửa giải khỏi cột ái lực miễn nhiễm (trong trường hợp này là 5 ml), tính bằng mililit (ml);

m_s        là khối lượng mẫu được lấy để phân tích (trong trường hợp này là 50 g) tính bằng gam (g).

9 Độ chụm

...

...

...

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Bảng B.1. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các dải nồng độ phân tích và các chất nền khác với dải nồng độ phân tích và các chất nền đã nêu trong Phụ lục B.

9.2 Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong cùng một khoảng thời gian ngắn nhất, không được quá 5 % giá trị giới hạn lặp lại.

Các giá trị đối với thực phẩm dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh) là:

 = 0,10 μg/kg                         r = 0,011 μg/kg              (đã bổ sung aflatoxin B₁)

 = 0,18 μg/kg                         r = 0,067 μg/kg              (đã bổ sung aflatoxin B₁)

 = 0,07 μg/kg                         r = 0,028 μg/kg

 = 0,09 μg/kg                         r = 0,020 μg/kg

 = 0,17 μg/kg                         r = 0,059 μg/kg

...

...

...

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, được báo cáo từ hai phòng thử nghiệm không được quá 5 % giá trị giới hạn tái lập R.

Giá trị đối với thực phẩm dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh) là:

 = 0,10 μg/kg                         r = 0,034 μg/kg              (đã bổ sung aflatoxin B₁)

 = 0,18 μg/kg                         r = 0,118 μg/kg              (đã bổ sung aflatoxin B₁)

 = 0,07 μg/kg                         r = 0,048 μg/kg

 = 0,09 μg/kg                         r = 0,022 μg/kg

 = 0,17 μg/kg                         r = 0,109 μg/kg

10 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

...

...

...

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày lấy mẫu và quy trình lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f)  kết quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị kết quả;

g) các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

h) mọi chi tiết thao tác khác với quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

...

...

...

Sắc đồ điển hình

CHÚ DẪN:

X          thời gian (phút)

Y          huỳnh quang (mV)

1          aflatoxin B₁

Các điều kiện vận hành:

Cột                          LC-18 Supelcosil^® 3), đường kính trong 4,6 mm, dài 25 cm

Tốc độ dòng            1 ml/min

...

...

...

Nhiệt độ cột             Nhiệt độ phòng

Thể tích bơm            1000 μl

Dẫn xuất                  Brom được điều chế bằng phương pháp điện hóa

Detector                   Huỳnh quang, bước sóng kích thích 365 nm, bước sóng phát xạ 435 nm, dải thông 18 nm.

Hình A.1 - Sắc đồ điển hình của aflatoxin B₁, trong thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh sau khi làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm (mức nhiễm aflatoxin B₁ là 0,1 μg/kg)

Phụ lục B

(tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

...

...

...

Bảng B.1 - Dữ liệu về độ chụm trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với thực phẩm dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh)

Mẫu

1

2

3^a

4^a

5^a

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

1999

...

...

...

1999

1999

1999

Số lượng phòng thử nghiệm

14

14

14

14

14

...

...

...

1

1

1

1

1

Số lượng phòng thử nghiệm được giữa lại sau khi trừ ngoại lệ

11

14

14

...

...

...

13

Số lượng ngoại lệ (phòng thử nghiệm)

3

0

0

3

1

Số lượng các kết quả được chấp nhận

11

...

...

...

14

11

13

Giá trị trung bình, , μg/kg

0,10

0,18

0,07

0,09

0,17

...

...

...

0,004

0,024

0,010

0,007

0,021

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r, %

3,5

13

14

...

...

...

12

Giới hạn lặp lại, r[r = 2,8 x s_r], μg/kg

0,011

0,067

0,028

0,020

0,059

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, μg/kg

0,012

...

...

...

0,017

0,008

0,039

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R, %

12

23

23

9

23

...

...

...

0,034

0,118

0,048

0,022

0,109

Độ thu hồi, %

101

92

-

...

...

...

-

Giá trị HorRat, theo [7]

0,19

0,39

0,34

0,14

0,39

Giá trị HorRat_R, theo [8]

0,55

...

...

...

1,01

0,41

1,05

^a Mẫu nhiễm tự nhiên

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[2] TCVN 6910-4 : 2001 (ISO 5725-4 : 1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 4: Phương pháp cơ bản xác định độ đúng của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[3] TCVN 6910-6 : 2002 (ISO 5725-6 : 1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 6: Sử dụng các giá trị độ chính xác trong thực tế.

...

...

...

[5] Nesheim, S.; Trucksess, M.W.; Page, S.W., Molar absorptivities of aflatoxin B-1, B-2, G(1), and G(2) in acetonitrile, methanol, and toluene-acetonitrile (9+1) (modification of AOAC official method 971.22): Collaborative study, Journal of AOAC international, 1999, 82 (2), p. 251-258.

[6] Stroka, J.; Anklam, Ε.; Joerissen, U.; Gilbert, J., Immunoaffinity column clean-up with liquid chromatography using post-column bromination for the determination of aflatoxin B₁ in baby food: Collaborative study. Journal of AOAC International, 2001, 84, p. 1116.

[7] Horwitz, W.; Albert, R., The Horwitz Ratio (HorRat): A useful Index of Method Performance with Respect to Precision. Journal of AOAC International, 2006, 89, p. 1095-1109.

[8] Thompson M., Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing, Analyst, 2000, 125, p. 385-386.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9522:2012 (EN 15851 : 2010) về Thực phẩm - Xác định aflatoxin B1 trong thực phẩm chế biến từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ - Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm và detector huỳnh quang