3.8.4. Dung dịch chuẩn nội, 80 mg/ml

Pha loãng 4 ml dung dịch chuẩn gốc TMP (3.8.2) trong 50 ml nước.

3.8.5. Dung dịch chuẩn làm việc, 40 mg/ml

Dùng pipet lấy 2 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc AMP, CMP, GMP, IMP và UMP (3.8.2) vào cùng một bình định mức 50ml và thêm nước đến vạch.

3.8.6. Dung dịch hiệu chuẩn, nồng độ danh nghĩa theo quy định trong Bảng 2.

Bảng 2 - Nồng độ danh nghĩa của các dung dịch hiệu chuẩn

Dung dịch hiệu chuẩn

Nồng độ AMP, CMP, GMP, IMP và UMP, mg/ml

Nồng độ TMP, mg/ml

...

...

...

0,4

3,2

2

0,8

3,2

3

3,2

3,2

4

...

...

...

3,2

3.8.6.1. Dung dịch hiệu chuẩn 1

Dùng pipet lấy 0,25 ml dung dịch chuẩn làm việc (3.8.5) và 1 ml dung dịch chuẩn nội (3.8.4) vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

3.8.6.2. Dung dịch hiệu chuẩn 2

Dùng pipet lấy 0,5 ml dung dịch chuẩn làm việc (3.8.5) và 1 ml dung dịch chuẩn nội (3.8.4) vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

3.8.6.3. Dung dịch hiệu chuẩn 3

Dùng pipet lấy 2 ml dung dịch chuẩn làm việc (3.8.5) và 1 ml dung dịch chuẩn nội (3.8.4) vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

3.8.6.4. Dung dịch hiệu chuẩn 4

Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch chuẩn làm việc (3.8.5) và 1 ml dung dịch chuẩn nội (3.8.4) vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

...

...

...

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1. Hệ thống HPLC, được trang bị bơm, bộ bơm mẫu với vòng bơm 50 ml, bộ khử khí, buồng cột và detector mảng diot.

4.2. Cột C18, loại Gemini có cỡ hạt 5 mm, kích thước 250 mm x 4,6 mm 1) hoặc tương đương.

4.3. Máy đo phổ.

4.4. Dụng cụ đo pH.

4.5. Ống li tâm, làm bằng polypropylen, dung tích 50 ml.

4.6. Xyranh sử dụng một lần, dung tích 3 ml.

4.7. Bộ lọc màng, với màng lọc bằng xenlulo axetat, cỡ lỗ 0,2 mm.

4.8. Bộ bơm chân không SPE.

...

...

...

4.10. Màng lọc, bằng nylon cỡ 0,45 mm.

4.11. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg.

4.12. Máy vortex.

4.13. Lọ đựng mẫu.

5. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không được hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.

6. Cách tiến hành

6.1. Chuẩn bị mẫu thử

...

...

...

6.2. Chiết mẫu

LƯU Ý: Trong quá trình chiết, không để cột bị khô mà cho từng giọt chảy vào cột, với tốc độ dòng nhỏ hơn 2 ml/min.

Đối với mỗi mẫu thử, đặt cột SPE (4.9) nối với bơm chân không (4.8). Ổn định cột bằng cách rửa giải với 4 ml metanol (3.1) sau đó rửa giải hai lần bằng nước, mỗi lần dùng 5 ml. Cho 4 ml dung dịch mẫu thử (6.1) lên cột. Rửa cột bằng 4 ml dung dịch kali bromua (3.4) để loại bỏ các chất gây nhiễu.

Rửa giải các nucleotid bằng 4ml dung dịch rửa giải SPE (3.5), cho vào ống nghiệm. Lọc dịch rửa giải qua bộ lọc màng 0,2 mm (4.7), lấy khoảng 2 ml dịch lọc vào lọ đựng mẫu (4.13).

6.3. Tiến hành sắc kí

Tạo gradient bằng cách trộn dung môi pha động A (3.6) và dung môi pha động B (3.7) theo quy trình quy định trong Bảng 3.

Bảng 3 - Quy trình gradient để phân tách bằng sắc kí

Thời gian, min

Tốc độ dòng, ml/min

...

...

...

Pha B, %

0

0,6

100

0

25

0,6

80

20

...

...

...

0,6

100

0

40

0,6

100

0

Dải phổ yêu cầu nằm trong khoảng từ 210 nm đến 300 nm, dùng detector mảng diot với chương trình sắc kí được cài đặt tại các bước sóng quy định sau đây trước khi định lượng.

- đối với IMP: 250nm;

...

...

...

- đối với CMP và UMP: 270 nm;

Cài đặt nhiện độ buồng cột ở 40^oC.

6.4. Dựng đường chuẩn

Dựng đường cong hồi quy tuyến tính theo tỉ lệ của diện tích pic (các nucleotid và TMP) trên trục y so với tỉ lệ của các nồng độ tương ứng trên trục x của các dung dịch hiệu chuẩn và tính độ dốc khi đưa giao điểm với trục y về 0.

7. Tính kết quả

7.1. Tính độ tinh khiết của mỗi nucleotid (dưới dạng axit tự do) của chất chuẩn, P, tính bằng phần trăm (%), theo công thức sau:

P = x  x                   (1)

Trong đó:

A là độ hấp thụ tia UV tại bước sóng cực đại;

...

...

...

W₁ là khối lượng của chất chuẩn gốc nucleotid, tính bằng gam (g);

V₁ là thể tích của dung dịch chuẩn gốc, tính bằng mililit (V₁ = 50 ml);

V₂ là thể tích của dung dịch chuẩn xác định độ tinh khiết, tính bằng mililit (V_2­ = 50 ml);

V₃ là thể tích của dung dịch chuẩn gốc bổ sung vào dung dịch chuẩn xác định độ tinh khiết, tính bằng mililit (V₃ = 1 ml).

7.2. Tính nồng độ của nucleotid trong các dung dịch chuẩn gốc, X₁, bằng microgam trên mililit mẫu (mg/ml), theo công thức sau:

X₁ =  x  x 10⁶               (2)

Trong đó:

W₁ là khối lượng của các chất chuẩn gốc nucleotid, tính bằng gam (g);

V₁ là thể tích của dung dịch chuẩn gốc, tính bằng mililit (V­­₁ = 50 ml);

...

...

...

100 là hệ số chuyển đổi từ phần trăm sang số thập phân;

10⁶ là hệ số chuyển đổi từ gam trên mililit (g/ml) sang microgam trên mililit (mg/ml).

7.3. Tính nồng độ của TMP trong dung dịch chuẩn nội, X₂, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml), theo công thức sau:

X₂ = X₁ x                             (3)

Trong đó:

X₁ là nồng độ của nucleotid trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

V₄ là thể tích dung dịch chuẩn gốc trong dung dịch chuẩn nội, tính bằng mililit (V₄ = 4ml);

V₅ là thể tích dung dịch chuẩn nội, tính bằng mililit (V­₅ = 50 ml).

7.4. Tính nồng độ nucleotid trong dung dịch hiệu chuẩn, X₃, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml), theo công thức sau:

...

...

...

Trong đó:

X₁ là nồng độ của nucleotid trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

V₆ là thể tích dung dịch chuẩn gốc trong dung dịch chuẩn làm việc, tính bằng mililit (V_­6 = 2 ml);

V_­7 là thể tích dung dịch chuẩn làm việc, tính bằng mililit (V­­­₇ = 50 ml);

V_8­ là thể tích dung dịch chuẩn làm việc trong dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng mililit (ml);

V­­­₉ là thể tích dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng mililit (V₉ = 25 ml).

7.5. Tính nồng độ của TMP trong dung dịch hiệu chuẩn, X₄, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml), theo công thức sau:

X₄ = X₂ x                (5)

Trong đó:

...

...

...

V₁₀ là thể tích dung dịch chuẩn làm việc trong dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng mililit (V₁₀ = 1 ml);

V₁₁ là thể tích dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng mililit (V₁₁ = 25 ml).

7.6. Hàm lượng nucleotid bổ sung được tính dựa trên đường chuẩn.

Đối với mẫu dạng bột, tính hàm lượng nucleotid, X, tính bằng miligam trên hectogam (mg/hg), theo công thức sau:

X =  x  x  x                    (6)

Đối với mẫu dạng lỏng, tính hàm lượng nucleotid, X, tính bằng miligam trên dexilit (mg/dl), theo công thức sau:

X =  x  x  x                   (7)

Trong đó:

A_NT là diện tích pic nucleotid tương ứng với mẫu thử;

...

...

...

L là độ dốc của đường chuẩn hồi quy tuyến tính;

C_IS là nồng độ của chất chuẩn nội bổ sung vào mẫu thử, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

V_IS là thể tích chất chuẩn nội bổ sung vào mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

W là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

V là thể tích mẫu thử dạng lỏng, tính bằng mililit (ml);

100 là hệ số chuyển đổi từ gam sang hectogam hoặc từ mililit sang dexilit;

1000 là hệ số chuyển đổi từ microgam sang miligam hoặc từ mililit sang lít.

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

...

...

...

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Gill, Brendon D.; Indyk, Harvey E.; Kumar, Maureen C.; Sievwright, Nathan K.; Manley-Harris, Merilyn; Dowell, Dawn: Adult/Pediatric Nutritional Formula by Liquid Chromatography, J. AOAC International Vol. 95, No. 3, 2012, pp. 599-602(4).

1) Có thể sử dụng sản phẩm Phenomenex, Torrance, CA, USA. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9515:2012 về Thực phẩm - Xác định 5' -mononucleotid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)