6.4.3. Dung dịch chuẩn axit folic (1 μg/ml)

Cho 5 ml dung dịch gốc (6.4.1) vào 475 ml nước và chỉnh pH đến 7,5 bằng natri hydroxit (4.2.7). Thêm nước đến 500 ml. Chuẩn bị dung dịch ngay trong ngày sử dụng. Có thể cần pha loãng tiếp để phù hợp với quy mô phân tích.

6.4.4. Dung dịch chuẩn axit folic pha loãng (100 ng/ml), để dùng với chủng cấy

Cho 10 ml dung dịch chuẩn (6.4.3) vào khoảng 60 ml nước và chỉnh pH đến 7,5 bằng natri hydroxit (4.2.7). Pha loãng bằng nước đến 100 ml. Chuẩn bị dung dịch ngay trong ngày sử dụng.

6.5. Tiến hành xác định

6.5.1. Yêu cầu chung

Xác định hàm lượng axit folic trong các chế phẩm enzym được sử dụng và điều chỉnh cho phù hợp.

6.5.2. Xử lý dung dịch chuẩn (1 μg/ml)

Xử lý 1 ml dung dịch chuẩn (6.4.3) tương tự nhe xử lý mẫu thử và tiến hành quy trình chiết và xử lý enzym như trong 6.3. Nồng độ của axit folic thu được thường là 10 ng/ml.

...

...

...

6.5.3.1. Yêu cầu chung

Các bước pha loãng nêu trong 6.5.3.2, 6.5.3.3, 6.5.3.4 áp dụng cho quy trình thử chuẩn trong ống nghiệm. Đối với phương pháp dùng đĩa 96 giếng thì tiến hành đến 6.5.4.3.

Có thể điều chỉnh các bước pha loãng để bù cho mức nồng độ folat cao hoặc thấp.

6.5.3.2. Dung dịch hiệu chuẩn (0,3 ng/ml)

Dùng pipet lấy 7,5 ml dung dịch chuẩn đã xử lý (6.5.2) cho vào bình định mức 250 ml. Thêm 7,5 ml đệm phosphat pH 6,1 (4.3.5) và pha loãng bằng nước đến 250 ml.

6.5.3.3. Dung dịch hiệu chuẩn thứ cấp (0,2 ng/ml và 0,4 ng/ml) (tùy chọn)

Dùng pipet lấy 5 ml và 10 ml dung dịch chuẩn đã xử lý (6.5.2) cho vào bình định mức 250 ml. Thêm một thể tích tương đương đệm phosphat pH 6,1 (4.3.5) và pha loãng bằng nước đến 250 ml.

6.5.3.4. Mẫu thử

Đối với mỗi mẫu, dùng pipet lấy 5 ml dung dịch mẫu thử đã xử lý enzym (6.3.3) cho vào bình định mức 250 ml. Thêm 5 ml đệm phosphat pH 6,1 (4.3.5) và pha loãng bằng nước đến 250 ml.

...

...

...

6.5.4.1. Yêu cầu chung

Giá trị pH ban đầu của dung dịch trong quá trình ủ ấm phải là 6,1 ± 0,1.

Có thể thực hiện phép thử vi sinh vật trong ống nghiệm hoặc trong đĩa 96 giếng. Thể tích của các dung dịch hiệu chuẩn, các dịch chiết mẫu và môi trường thử có thể thay đổi tùy thuộc vào phương thức của phép thử. Các ví dụ điển hình về các thể tích v.v…được nêu trong 6.5.4.2 và 6.5.4.3.

6.5.4.2. Phương pháp dùng ống nghiệm

Việc bổ sung các dung dịch vào ống nghiệm được nêu trong Bảng 1.

Chuẩn bị 21 ống nghiệm (ví dụ: 20 mm x 150 mm) để dùng cho các dung dịch hiệu chuẩn (0 ng/ml, 0 ng/ml, 0,03 ng/ml, 0,06 ng/ml, 0,09 ng/ml, 0,12 ng/ml, 0,15 ng/ml). Chia thành 3 dãy, mỗi dãy cho lần lượt 0 ml, 0 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml và 5 ml dung dịch hiệu chuẩn đã pha loãng (6.5.3.2) vào các ống nghiệm.

CHÚ THÍCH Ba dãy ống 0 ml sẽ được sử dụng làm mẫu trắng không cấy.

Tùy chọn: Chuẩn bị 15 ống nghiệm (ví dụ: 20 mm x 150 mm) cho mỗi dung dịch hiệu chuẩn thứ cấp. Chia thành 3 dãy, mỗi dãy cho lần lượt 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml và 5 ml dung dịch hiệu chuẩn thứ cấp đã pha loãng (6.5.3.3) vào các ống nghiệm.

Chuẩn bị 12 ống nghiệm (ví dụ: 20 mm x 150 mm) để dùng cho mỗi mẫu. Chia thành 3 dãy, mỗi dãy cho lần lượt 1 ml, 2 ml, 3 ml, và 4 ml dung dịch mẫu đã pha loãng (6.5.3.4).

...

...

...

Bảng 1 – Bổ sung các dung dịch vào các ống nghiệm theo 6.5.4.2

Số lượng lặp lại

Dung dịch hiệu chuẩn (0,3 ng/ml)

Dung dịch mẫu đã pha loãng

Nước

Dung dịch môi trường cơ bản nồng độ kép

Mẫu trắng không cấy

3

...

...

...

-

5 ml

5 ml

Chất hiệu chuẩn (0 ng/ml)

-

-

5 ml

5 ml

...

...

...

3

1 ml

-

4 ml

5 ml

Chất hiệu chuẩn (0,06 ng/ml)

3

2 ml

-

...

...

...

5 ml

Chất hiệu chuẩn (0,09 ng/ml)

3

3 ml

-

2 ml

5 ml

Chất hiệu chuẩn (0,12 ng/ml)

3

...

...

...

-

1 ml

5 ml

Chất hiệu chuẩn (0,15 ng/ml)

3

5 ml

-

-

5 ml

...

...

...

3

-

1 ml

4 ml

5 ml

Mẫu 1 (dung dịch pha loãng 2)

3

-

2 ml

...

...

...

5 ml

Mẫu 1 (dung dịch pha loãng 3)

3

-

3 ml

2 ml

5 ml

Mẫu 1 (dung dịch pha loãng 4)

3

...

...

...

4 ml

1 ml

5 ml

Mẫu 2 (dung dịch pha loãng 1)

3

-

1 ml

4 ml

5 ml

...

...

...

3

-

2 ml

3 ml

5 ml

v.v…

...

...

...

Đậy nắp các ống nghiệm và làm nóng ở nhiệt độ từ 121 ^oC đến 123 ^oC trong 5 min. Làm nguội thật nhanh đến dưới + 40 ^oC. Xử lý tất cả các dung dịch hiệu chuẩn và các mẫu giống nhau.

Trong điều kiện vô trùng, dùng bơm tiêm vô trùng hoặc dụng cụ tương tự cấy vào mỗi ống nghiệm 50 μl dịch cấy làm việc (4.5.4), ngoại trừ 1 bộ gồm 3 ống mẫu trắng (chứa 0 ml dung dịch hiệu chuẩn pha loãng).

Ủ ở 37 ^oC ± 0,2 ^oC trong thời gian từ 15 h đến 24 h.

Trộn và đặt các ống mẫu trắng không cấy vào máy đo phổ cài đặt bước sóng từ 550 nm đến 650 nm và chỉnh để đạt 100% sự truyền qua ở trạng thái tĩnh. Đọc độ hấp thụ trên các ống nghiệm còn lại ở trạng thái tĩnh. Khoảng thời gian từ khi trộn đến khi đo phải giống nhau.

6.5.4.3. Phương thức sử dụng đĩa (tùy chọn)

Dùng pipet 12 đầu, chuyển 150 μl đệm phosphat (4.3.5) vào các giếng A1-H12 trong đĩa 96 giếng vô trùng.

Dùng pipet lấy 150 μl dung dịch chuẩn đã xử lý enzym (6.5.2) cho vào các giếng G1 – G2.

Đối với mỗi dung dịch mẫu thử đã xử lý enzym (6.3.3), dùng pipet lấy 150 μl lặp lại hai lần cho vào các giếng trong dãy G. Trộn kỹ.

...

...

...

Thêm 150 μl dung dịch môi trường cơ bản không chứa axit folic đã cấy (4.5.5) vào các giếng A1-H12.

Đặt đĩa vào vật chứa bằng chất dẻo và làm kín. Đặt một nồi nước trong vật chứa để đảm bảo đủ độ ẩm làm hạn chế bay hơi nước ra khỏi giếng. Ủ đĩa ở 37 ^oC từ 15 h đến 24 h. Lấy đĩa ra và để nguội đến nhiệt độ phòng.

Dùng pipet 12 đầu trộn hỗn hợp chứa trong mỗi giếng bằng cách hút nhả cho đến khi huyền phù vi sinh vật đồng nhất.

Đọc độ hấp thụ của tất cả các giếng trên máy đọc đĩa ở bước sóng từ 550 đến 650 nm sử dụng các mẫu trắng đã cấy (H1-H12) làm đối chứng.

7. Tính kết quả

7.1. Đường chuẩn

Vẽ các điểm dữ liệu độ hấp thụ đối với tất cả các mức hiệu chuẩn so với khối lượng tương ứng của axit folic và dựng đường chuẩn.

7.2. Mẫu thử

Xác định khối lượng folat bằng nanogam của mỗi dung dịch mẫu thử pha loãng trong 6.5.4.2 (trung bình của số đọc ba lần lặp lại) bằng cách nội suy từ đường chuẩn.

...

...

...

Trong đó:

m₁

là khối lượng folat có trong mỗi dung dịch mẫu thử pha loãng trong 6.5.4.2 đọc được từ đường chuẩn, tính bằng nanogam (ng);

m₂

là khối lượng folat có trong các chế phẩm enzym được sử dụng, tính bằng nanogam (ng);

V₁

là tổng thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử trong 6.5.3.4, tính bằng mililít;

m₃

...

...

...

V₂

là thể tích dung dịch mẫu thử được chuyển vào ống nghiệm trong 6.5.4.2, tính bằng mililít (ml);

100

là hệ số chuyển đổi để thu được kết quả trên 100 g mẫu thử;

1000

là hệ số chuyển đổi để thu được kết quả tính bằng microgram folat.

7.3. Tiêu chí chấp nhận dữ liệu

Tiêu chí để chấp nhận các dữ liệu có thể phụ thuộc vào quy mô phép thử và phải do mỗi phòng thử nghiệm tự thiết lập. Ít nhất cũng phải xem xét các thông số sau:

- độ đục tối đa của các mẫu trắng đã cấy;

...

...

...

- sự khác nhau giữa các độ hấp thụ thu được ở mỗi mức hiệu chuẩn;

- sự khác nhau về lượng folat tính được giữa tất cả các độ pha loãng của dung dịch mẫu thử;

- phân tích chất chuẩn có liên quan đã được chứng nhận (nếu có thể);

Tiêu chí để chấp nhận dữ liệu có thể bao gồm việc kiểm tra các kết quả với axit folic – 5 – formyltetrahydro làm chất chuẩn. Các kết quả cần tương đương với kết quả thu với axit folic làm chất chuẩn.

7.4. Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả là phần khối lượng folat tổng số có trong mẫu thử (μg/100 g)

8. Độ chụm

8.1. Yêu cầu chung

Độ chụm của phương pháp được thiết lập bởi các phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725 [0]. Các kết quả thu được từ các phép thử này được nêu trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng này có thể không áp dụng được để phân tích các dải nồng độ và chất nền khác với dải nồng độ và chất nền nêu trong Phụ lục B.

...

...

...

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả riêng rẽ, thu được khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

Các giá trị này là:

Bột mì nguyên cám (CRM 121)

 = 50,0 μg/100 g

r  = 12,9 μg/100 g

Sữa bột (CRM 421)

 = 142 μg/100 g

r  = 26 μg/100 g

Rau hỗn hợp (CRM 485)

...

...

...

r  = 43 μg/100 g

Gan lợn (CRM 487)

 = 1330 μg/100 g

r  = 307 μg/100 g

8.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ, thu được bởi hai phòng thử nghiệm khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, không quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R.

Các giá trị này là:

Bột mì nguyên cám (CRM 121)

 = 50,0 μg/100 g

...

...

...

Sữa bột (CRM 421)

 = 142 μg/100 g

R  = 67 μg/100 g

Rau hỗn hợp (CRM 485)

 = 315 μg/100 g

R  = 122 μg/100 g

Gan lợn (CRM 487)

 = 1330 μg/100 g

R  = 637 μg/100 g

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày và quy trình lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) các kết quả và các đơn vị biểu thị kết quả;

g) các điểm đặc biệt quan sát được trong khi tiến hành thử nghiệm;

h) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tùy chọn;

...

...

...

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

VIỆC XỬ LÝ ENZYM TÙY CHỌN

A.1. Yêu cầu chung

Việc xử lý mẫu thử bằng cách bổ sung các enzym có thể tạo thuận tiện cho việc chiết folat [5] đến [9]. Có thể bổ sung protease và α-amylase hoặc hỗn hợp của hai enzym này đồng thời vào các mẫu giàu protein và tinh bột. Cần phải tối ưu hóa các điều kiện (ví dụ: trình tự bổ sung, pH và nhiệt độ ủ) đối với loại mẫu cần nghiên cứu. Các ví dụ về quy trình xử lý bổ sung enzym được nêu trong A.2 và A.3.

Có thể cần phải lọc dịch chiết, nhất là khi có xử lý enzym. Có thể lọc dễ dàng hơn bằng cách chỉnh pH đến 4,5 trước khi pha loãng và chiết.

Có thể chuẩn bị y-glutamyl hydrolase từ một trong nhiều nguồn. Phải chú ý bảo đảm đủ hoạt tính của y-glutamyl hydrolase đối với chế phẩm enzym được sử dụng và tối ưu hóa pH và nhiệt độ khi ủ [10], [11]. Có thể cần đến hỗn hợp của các chế phẩm enzym khác nhau. Việc chuẩn bị y-glutamyl hydrolase từ thận lợn được mô tả trong 4.4.2.2 và các nguồn tùy chọn được mô tả trong A.4, A.5, A.6.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng bột axeton thận lợn loạt ll3 làm nguồn thu y-glutamyl hydrolase.

...

...

...

A.2.1. Protease

Protease vi khuẩn (mycolysin, EC 3.4.24.31) [12] từ Streptomyses griseus hoặc tương đương³⁾.

A.2.2. Dung dịch protease (2 mg/ml)

Hòa tan 0,05 g protease vi khuẩn vào 25 ml nước. Lọc qua bông thủy tinh nếu cần và bảo quản trong tủ lạnh. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

A.2.3. Cách tiến hành

Thêm 1 ml dung dịch protease (A.2.2) vào dịch chiết mẫu (6.3.2) đậy nắp và ủ ở +37^oC trong 3 h. Khử hoạt hóa của enzym bằng cách làm nóng ở 100 ^oC trong 3 min và để nguội. Xử lý tiếp bằng α-amylase (A.3) hoặc bằng y-glutamyl hydrolase (6.3.3 hoặc A.4).

A.3. Xử lý α-amylase

A.3.1. α-amylase

α-amylase nấm (EC 3.2.1.1), [12], hoặc tương đương³⁾.

...

...

...

Hòa tan 0,5 g α-amylase nấm (A.3.1) trong 25 ml nước. Bảo quản trong tủ lạnh. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

A.3.3. Cách tiến hành

Thêm 1 ml dung dịch α-amylase (A.3.2) vào dịch chiết mẫu (6.3.2) đậy nắp và ủ ở +37^oC trong 2 h. Khử hoạt tính của enzym bằng cách làm nóng ở 100 ^oC trong 3 min và để nguội. Xử lý tiếp bằng α-amylase (A.3) hoặc bằng y-glutamyl hydrolase (6.3.3 hoặc A.4).

A.4. Nguồn y-glutamyl hydrolase tùy chọn: tuyến tụy gà

A.4.1. Tuyến tụy gà khô³⁾

A.4.2. Dung dịch tuyến tụy gà (5 mg/ml)

Hòa tan 0,5 ml tụy gà vào trong 100 ml đệm phosphat (4.3.6). Khuấy mạnh trong 10 min. Chuyển vào các ống nghiệm 20 mm x 150 mm rồi cho ly tâm trong 10 min ở 1000 g. Gạn phần nổi phía trên qua bông thủy tinh vào cốc có mỏ, đậy nắp cốc và bảo quản trong tủ lạnh. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

A.4.3. Cách tiến hành

Trộn cẩn thận 1 ml dịch chiết mẫu (6.3.2), 3,5 ml đệm phosphat chứa ascorbat pH 7,8 (4.3.6) và 0,6 ml dung dịch tụy gà (A.4.2). Ủ ở 37 ^oC trong 16 h. Khử hoạt tính enzym bằng cách làm nóng ở 100 ^oC trong 3 min và để nguội. Chuyển vào bình định mức 10 ml và thêm chất đệm phosphat chứa ascorbat pH 6,1 (4.3.5) cho đến vạch. Cho ly tâm (10 min ở 1000 g) để loại bỏ protein kết tủa. Bảo quản phần nổi trên ở nhiệt độ 20 ^oC để phân tích tiếp.

...

...

...

A.5.1. Huyết tương máu chuột, tươi³⁾

A.5.2. Huyết tương máu chuột đã thẩm tách [13]

Chuyển 100 ml huyết tương máu chuột tươi vào bình thẩm tách (5.6) và thẩm tách trong đệm CHES/HEPES, pH 7,85 (4.3.7) ở 4 ^oC trong 24 h. Bảo quản huyết tương máu chuột đã thẩm tách với các lượng 0,5 ml ở nhiệt độ - 80 ^oC trong tối đa ba tháng.

A.5.3. Cách tiến hành

Trộn cẩn thận 1 ml dịch chiết mẫu (6.3.2), 2,75 ml đệm phosphat chứa ascorbat pH 7,8 (4.3.6), 1 ml của 2-mercaptoethanol (4.2.4) và 0,25 ml huyết tương máu chuột đã thẩm tách (A.5.2). Ủ ở 37 ^oC trong 4 h. Khử hoạt tính của enzym bằng cách làm nóng ở 100 ^oC trong 3 min và để nguội. Chỉnh pH đến 6,1 bằng axit clohydric (4.2.6). Chuyển vào định mức 10 ml và pha loãng bằng đệm phosphat chứa ascorbat pH 6,1 (4.3.5) cho đến vạch. Cho ly tâm (10 min ở 1000 g) để loại bỏ protein kết tủa. Bảo quản phần nổi phía trên ở nhiệt độ - 18 ^oC để phân tích tiếp.

A.6. Nguồn y-glutamyl hydrolase tùy chọn: huyết tương máu người

A.6.1. Huyết tương máu chuột, đông khô

A.6.2. Huyết tương máu người hoàn nguyên

Hoàn nguyên huyết thanh người đông khô bằng 5 ml nước và khuấy nhẹ trong 30 min ở nhiệt độ phòng. Bảo quản trong đá lạnh. Chuẩn bị ngay trong ngày sử dụng.

...

...

...

Trộn cẩn thận 1 ml dịch chiết mẫu (6.3.2), 2,75 ml đệm phosphat chứa ascorbat pH 4,5 (4.3.4), 1 ml của 2-mercaptoethanol (4.2.4) và 0,25 ml huyết tương máu người đã hoàn nguyên (A.6.2). Ủ ở 37 ^oC trong 3h. Khử hoạt tính của enzym bằng cách làm nóng ở 100 ^oC trong 3 min và để nguội. Chỉnh pH đến 6,1 bằng natri hydroxit (4.2.7). Chuyển vào định mức 10 ml và pha loãng bằng đệm phosphat chứa ascorbat pH 6,1 (4.3.5) đến vạch. Cho ly tâm (10 min ở 1000 g) để loại bỏ protein kết tủa. Bảo quản phần nổi phía trên ở nhiệt độ - 18 ^oC để phân tích tiếp.

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

KẾT QUẢ CỦA CÁC PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

Độ chụm của phương pháp đã xác lập bởi các phép thử liên phòng thử nghiệm trong Chương trình Tiêu chuẩn, Đo lường và Thử nghiệm của EU (EU SMT) và được thực hiện theo ISO 5725. Các kết quả thử nghiệm này đã được công bố [2].

CHÚ THÍCH: Sau khi thực hiện các thử nghiệm này, ISO 5725:1986 đã được thay thế bằng ISO 5725-1, ISO 5725-2, ISO 5725-3, ISO 5725-4 và ISO 5725-6 (các phần này được ban hành năm 1994) và ISO 5725-5:1998. Các tiêu chuẩn này đã được chấp nhận thành bộ tiêu chuẩn TCVN 6910 (ISO 5725).

Bảng B.1 – Kết quả thống kê của các phép thử liên phòng thử nghiệm về xác định hàm lượng folat tổng số trong thực phẩm (EU SMT)

...

...

...

CRM 421 (Sữa bột)

CRM 485 (Rau hỗn hợp)

CRM 487 (Gan lợn)

Năm thực hiện thử nghiệm

1996

1996

1996

1996

Số lượng phòng thử nghiệm

...

...

...

10

8

12

Số lượng dữ liệu

15

15

12

17

Số kết quả riêng lẻ

...

...

...

75

61

87

Số kết quả được chấp nhận

73

75

61

87

Trung bình của các bộ dữ liệu, μg/100g

...

...

...

142

315

1330

Độ lệch chuẩn lặp lại, (s_r) μg/100g

4,6

9

15

110

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, (RSD_r)

...

...

...

6,7%

4,9%

14,8%

Độ lệch chuẩn tái lập, (s_R) μg/100g

11,2

24

43

227

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, (RSD_R)

...

...

...

16,9%

13,8%

17,0 %

Độ lệch chuẩn trung bình các bộ dữ liệu, μg/100g

11,0

24

44

198

Nửa độ rộng của khoảng tin cậy 95% của trung bình các bộ dữ liệu, μg/100g

...

...

...

13

28

125

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[0] ISO 5725, Precision of lest methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by interlaboralory tests.

[1] Barrett, A.J., Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB). Enzyme Nomenclature. Recommendations 1992. Supplement 4: corrections and additions, 1997, Eur J Btochem. 1997, 250 (1):p.1-6.

[2] Finglas, P.M., et at., The certification of the mass fractions of vitamins in four reference materials; wholemeal flour (CRM 121), milk powder (CRM 421). lyophilized mixed vegetables (CRM 485) & lyophilized pig’s liver (CRM 487). B1, B6 & folate in CRM 121; B1, B2, B6, B12 & folate in CRMs 421 & 487. and B1, B6. folate & carotenoids in CRM 485. 1999. Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities.

[3] Gregory. J.F., III. Sartain, D.B, and Day, B.P.F: Fluorometric determination of folacin in diological materials using high performance liquid chromatography. Journal of Nutrition. 1984,114; p.341-353.

...

...

...

[5] Rader, J.I., Weaver, CM., and Angyal,G.; Use of a microbiological assay with tri-enzyme extraction for measurement of pre-fortification levels of folates in enriched cereal-gram products. Food Chemistry. 1998, 62(4): p.451-465.

[6] Pfeiffer, CM., Rogers, L.M., and Gregory, J.F., III: Determination of folate in cereal-gram food products using trienzyme extraction and combined affinity and reversed-phase liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1997, 45; p.407-413.

[7] Tamura, T., et al., Food folate assay with protease, α-Amylase. and folate conjugase treatments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1997-45:p. 135-139.

[8] Martin. J.I., Landen, W.I.Jr. and Soliman, A.G.M: Application of a tn-enzyme extraction for total folate determination in foods. Journal of the Association of Official Analytical Chemists. 1990. 73(5):p.SOS-SOS.

[9] DeSouza, S.and Eilenmiller. R.: Effect of different enzyme treatments on extraction of total folate from various foods prior to microbiological assay and radioassay. Journal of Micronulrient Analysis. 1990,7:p. 37-57

[10] Goli, D.M., and Vanderslice, J.T.: Investigation of the conjugage treatment procedure in the microbiological assay of folate. Food Chemistry. 1992.43:p. 57-64

[11] Pedersen, J.C.: Companson of gamma-glutamyl hydrolase (conjugase; EC 3.4.22.12) and amylase treatment procedures in the microbiological assay for food folates. British Journal of Nutrition, 1988.59(2):p.261-271.

[12] NC-IUBMB. Enzyme nomenclature 1992.1992, San Diego: Academic Press.

[13] Konings, E.J.M: A validated liquid chromatographic method for determining folates in vegetables, milk powder, liver, and flour. Journal of AOAC International, 1999.82 (1):p.119-127.

...

...

...

2) Các nhà cung cấp gồm có National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd (Aberdeen, Anh) và Culture Collection, University of Goteborg (Gotheburg, Thụy Điển). Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng, tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng.

3 Đây là ví dụ về sản phẩm của hãng Sigma hoặc Difco. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng, còn tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tương nếu chúng cũng cho kết quả tương tự.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8978:2011 (EN 14131 : 2003) về Thực phẩm - Xác định folat bằng phép thử vi sinh