6.2. Phương pháp đĩa tiếp xúc

Sau khi lấy ra khỏi hộp vận chuyển, ấn bề mặt thạch của đĩa tiếp xúc hoặc của phiến kính nhúng thật chặt và không bị dịch chuyển sang các bên của bề mặt thử nghiệm. Theo tài liệu cho biết rằng các kết quả tối ưu đối với các đĩa tiếp xúc thu được với thời gian tiếp xúc 10 s và lực nén có khối lượng 500 g. Đậy các đĩa tiếp xúc hoặc phiến kính ngay sau khi cấy và đặt trở lại vào hộp vận chuyển.

6.3. Phương pháp dùng gạc hoặc vài/bọt biển

6.3.1. Phương pháp dùng gạc

Lấy gạc ra khỏi bao gói vô trùng và làm ẩm đầu mút bằng cách nhúng vào ống nghiệm có chứa dịch pha loãng. Ấn đầu mút của miếng gạc vào thành ống để bỏ phần nước dư. Đặt đầu mút miếng gạc lên bề mặt cần kiểm tra và vạch trên một vùng rộng 20 cm² đến 100 cm², trong khi quay miếng gạc giữa ngón tay trỏ và ngón tay cái theo hai hướng từ các góc phải sang trái.

Bẻ hoặc cắt que cầm một cách vô trùng và đặt miếng gạc vào ống nghiệm đựng chất lỏng.

6.3.2. Phương pháp dùng bọt biển/vải

Mở túi hoặc hộp bằng chất dẻo đựng miếng vải hoặc miếng bọt biển.

Dùng kẹp vô trùng hoặc mang găng tay vô trùng để lấy miếng vải hoặc bọt biển ra. Làm ẩm bọt biển hoặc miếng vải bằng một lượng vừa đủ của dịch pha loãng. Đối với các bề mặt đã ẩm thì không cần.

...

...

...

Lấy mẫu bề mặt đã chọn theo hai hướng vuông góc, thay bề mặt của miếng vải hoặc bọt biển. Đặt miếng vải hoặc bọt biển này vào hộp đựng vô trùng, bổ sung dịch pha loãng và đậy nắp. Thêm một lượng vừa đủ đã xác định của dịch pha loãng sao cho miếng vải hoặc bọt biển vẫn ẩm cho đến khi phân tích.

Cách khác, mở túi chất dẻo chứa miếng vải hoặc bọt biển. kẹp chặt miếng bọt biển ở cuối túi, kéo túi ngược theo tay. Dùng miếng bọt biển để lấy mẫu như mô tả ở trên và chuyển miếng vải hoặc bọt biển vào túi chất dẻo vô trùng. Đậy thật kín nắp.

7. Vận chuyển

Vận chuyển mẫu đã lấy được bằng phương pháp dùng gạc, tốt nhất là trong khoảng 4 h để trong hộp lạnh ở 1⁰C đến 4⁰C. Tiến hành kiểm tra trong phòng thử nghiệm càng sớm càng tốt, không để quá 24 h, như mô tả trong Điều 8.

Chuyển đĩa tiếp xúc và/hoặc phiến kính nhúng, tốt nhất trong khoảng 4h để tránh nhiễm bẩn.

8. Cách tiến hành

8.1. Phương pháp dùng đĩa tiếp xúc

Ủ các đĩa tiếp xúc hoặc phiến kính nhúng tùy theo kiểu loại vi sinh vật cần đếm (xem Chú thích của Điều 4).

Không sử dụng phương pháp dùng đĩa tiếp xúc để phát hiện cụ thể các vi sinh vật gây bệnh.

...

...

...

Trộn kỹ lượng chứa trong các ống có chứa gạc, dùng bộ trộn (5.9) trong 30s, chỉnh tốc độ sao cho thành ống được làm ướt đến khoảng 2cm đến 3cm tính từ đỉnh ống.

Thêm một lượng dịch pha loãng hoặc chất trung hòa (4.1), tùy thuộc vào diện tích cần kiểm tra (ví dụ: 100ml cho 100cm²), vào túi chất dẻo đựng miếng vải hoặc bọt biển. Sau đó xử lý lượng chứa trong túi trong bộ trộn nhu động (5.10) trong 1 min, hoặc bằng bộ trộn lắc ngang (5.10) trong 30s, để thu được huyền phù ban đầu.

Nếu dự kiến có lượng lớn vi sinh vật thì chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo trong dịch pha loãng nước pepton để thu được số khuẩn lạc có thể đếm được [xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1)].

Tùy theo phương pháp định lượng được sử dụng (xem các tiêu chuẩn tương ứng), cấy huyền phù ban đầu vào các đĩa kép đựng môi trường, sử dụng 1 ml dịch cấy trên mỗi đĩa rót và 0,1 ml dịch cấy cho kỹ thuật dán đĩa. Xử lý các dung dịch pha loãng tiếp theo theo cùng cách. Lật ngược các đĩa và ủ trong khoảng thời gian và nhiệt độ thích hợp cho từng loại môi trường.

Để thay thế cho phương pháp đổ đĩa nói trên, có thể sử dụng phương pháp đĩa nhỏ giọt. Bắt đầu với dung dịch pha loãng nhất, dùng pipet vô trùng chuyển các lượng 0,05 ml các huyền phù ban đầu (gạc, vải hoặc bọt biển) và các dung dịch pha loãng tiếp theo sang các phần thích hợp của môi trường cấy đã được đánh dấu trên đáy đĩa thạch (các đĩa kép, sử dụng cùng dung dịch pha loãng đối với các đĩa thạch khác nhau). Mỗi đĩa thạch đã làm khô trước có thể được dùng để nhỏ giọt cho không nhiều hơn sáu dung dịch pha loãng khác nhau. Sử dụng kỹ thuật pipet hút ngược bằng cách ấn hẳn pittong xuống khi hút lượng 0,05 ml và cấy vào các đĩa bằng cách ấn pittong chỉ vào điểm dừng thứ nhất. Giữ các đĩa thạch ở tư thế nằm ngang (nắp hướng lên trên) cho đến bề mặt thạch khô.

Nếu sử dụng phương pháp dùng gạc để kiểm tra sự có mặt của các vi sinh vật cụ thể (ví dụ: Listeria monocytogens hoặc Salmonella spp.), thì diện tích cần kiểm tra ít nhất phải là 100 cm² và tốt nhất là 1000cm². Chuyển gạc, vải hoặc bọt biển vào canh thang tăng sinh thích hợp và trộn kỹ.

8.3. Phát hiện và đếm khuẩn lạc

8.3.1. Phương pháp đĩa tiếp xúc

Đếm số lượng các khuẩn lạc điển hình trên các đĩa tiếp xúc hoặc phiến kính nhúng trực tiếp sau thời gian ủ qui định và khẳng định theo các vi sinh vật cần tìm, nếu cần.

...

...

...

Đếm số lượng khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa và khẳng định theo các vi sinh vật cần tìm, nếu cần.

8.3.3. Phương pháp dùng đĩa nhỏ giọt

Đếm số lượng các khuẩn lạc trên mỗi đĩa tại các dung dịch pha loãng cho 5 đến 50 khuẩn lạc.

8.3.4. Qui trình tăng sinh

Sau khi tăng sinh sơ bộ, tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất đối với các vi sinh vật cần tìm.

9. Tính và biểu thị kết quả

CẢNH BÁO - Vì phương pháp dùng đĩa tiếp xúc và phương pháp dùng vải/gạc không cho các kết quả giống nhau, do đó cần phải nêu rõ trong kết quả phương pháp đã sử dụng.

9.1. Phương pháp dùng đĩa tiếp xúc

Chia số lượng các khuẩn lạc đặc trưng cho diện tích bề mặt của đĩa. Ghi lại số đếm là số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên centimet vuông bề mặt.

...

...

...

9.2.1. Tính số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên mililit huyền phù ban đầu, theo tiêu chuẩn có liên quan.

9.2.2. Tính số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên centimet vuông bề mặt cần kiểm tra, Ns, theo công thức sau đây:

N_s =

trong đó:

N là số lượng CFU trong 1 ml dung dịch pha loãng (hoặc chất lỏng trung hòa);

F là dung dịch pha loãng (hoặc chất lỏng trung hòa) trong ống hoặc trong túi đồng hóa, tính bằng mililit (ml);

A là bề mặt cần kiểm tra, tính bằng centimet vuông (cm²);

D là số nghịch đảo của độ pha loãng đã dùng.

9.2.3. Đối với phương pháp đĩa nhỏ giọt, tính số lượng N, CFU trên mililit dung dịch huyền phù, theo công thức sau:

...

...

...

trong đó

 là số lượng khuẩn lạc đếm được trên tất cả các giọt được giữ lại từ hai dung dịch pha loãng liên tiếp, trong đó ít nhất một giọt chứa 5 khuẩn lạc;

V là thể tích chất cấy đã dùng trong mỗi giọt (trong trường hợp này là 50 ml)

n₁ là số giọt được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;

n₂ là số giọt được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;

d là hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại.

Để thu được số đếm trên centimet vuông bề mặt, sử dụng công thức:

Trong đó

...

...

...

A là diện tích đã lau, tính bằng centimet vuông (cm²)

9.2.4. Nếu không xác định được diện tích đã lau, thì tính số lượng CFU trên mỗi miếng gạc, N_sw, theo công thức sau:

Khi sử dụng các phương pháp bán định lượng, thì các kết quả thu được theo CFU trên centimet vuông bề mặt có thể được gọi là điểm vệ sinh. Vì các điểm này có thể thay đổi nhiều tùy thuộc vào các bề mặt cần kiểm tra, do đó nên cần được các bên quan tâm xác định và đi đến thống nhất.

9.2.5. Trong trường hợp các quy trình tăng sinh, thì báo cáo vi sinh vật đích là phát hiện được hoặc không phát hiện được trong diện tích đã lau, hoặc trên mỗi miếng gạc nếu không biết diện tích.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] EN 1276:1997, Chemical disinfectants and antiseptics - Quantitative suspension tests for the evaluation of bactericidal activity of chemical disinfectants and antiseptics used in the food, industrial domestic and institutional areas - Test methods and requirements (phase 2, step 1)

[2] EN 1650:1997, Chemical disinfectants and antiseptics - Quantitative suspension test for the evaluation of fungicidal activity of chemical disinfectants and antiseptics in food, industrial, domestic, and industrial areas - Test method and requirements (phase 2 step 1)

...

...

...

[4] EN 13704:2002, Chemical disinfectants and antiseptics - Quantitative suspension test for the evaluation of spohcidal activity of chemical disinfectants used in food, industrial, domestic and industrial areas - Test and requirements (phase 2. step 1)

[5] TCVN 6263 (ISO 8261) Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn chung về chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật

[6] TCVN 8128-1: 2009 (ISO/TS 11133-1:2009), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị và sản xuất môi trường nuôi cấy - Phần 1: Hướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng đối với việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong phòng thử nghiệm.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8129:2009 (ISO 18593 : 2004) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp lấy mẫu bề mặt sử dụng đĩa tiếp xúc và lau bề mặt