5.3.2. Chuẩn bị

Tiến hành như sau để giữ được tính chọn lọc và đặc trưng của môi trường.

Trộn kỹ các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước và để yên vài phút. Chỉnh pH sao cho sau khi đun sôi pH bằng 7,4 ± 0,2 ở 25 °C. Đun đến sôi và thỉnh thoảng khuấy cho tan hết.

Giữ sôi trong 2 phút. Làm nguội ngay môi trường trong nồi cách thủy (6.5) ở nhiệt độ 44 °C đến 47 °C.

Để tránh làm quá nhiệt, không đun môi trường quá lâu cũng như không đun lại. Do đó, không khử trùng trong nồi áp lực và cần kiểm tra độ vô trùng của môi trường tại thời điểm sử dụng (xem 9.2.2).

Sử dụng môi trường trong vòng 4 h sau khi chuẩn bị.

5.3.3. Kiểm tra tính năng về đảm bảo chất lượng môi trường cấy

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Kiểm tra tính năng đối với thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể (VRBL) theo ISO/TS 11133-2:2003, Bảng B.1.

5.4. Môi trường khẳng định: Canh thang mật lactoza lục sáng

...

...

...

Dịch thủy phân casein bằng emzym

10 g

Lactoza (C₁₂H₂₂O₁₁.H₂O)

10 g

Mật bò khô

20 g

Lục sáng (Brilliant green)

0,0133 g

Nước

...

...

...

5.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng nhẹ, nếu cần, trên nồi cách thủy (6.5). Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển 10 ml môi trường vào từng ống nghiệm (6.7) chứa các ống Durham (6.8). Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C. Các ống Durham không được chứa bọt khí sau khi khử trùng.

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thử nghiệm vi sinh [Xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể sau:

6.1. Thiết bị để thanh trùng khô (tủ sấy) hoặc để thanh trùng ướt (nồi hấp áp lực)

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

6.2. Tủ ấm, có thể hoạt động ở 30 °C ± 1 °C hoặc 37 °C ± 1°C.

6.3. Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

...

...

...

6.5. Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự có khả năng hoạt động từ 44 °C đến 47 °C hoặc ở 100 °C.

6.6. Thiết bị đếm khuẩn lạc, gồm một nguồn chiếu sáng và dụng cụ đếm cơ học hoặc điện tử.

6.7. Ống nghiệm, kích thước khoảng 16 mm x 160 mm.

6.8. Ống Durham, có kích thước phù hợp với ống nghiệm (6.7).

6.9. Bình hoặc chai, để đun sôi và bảo quản môi trường cấy.

6.10. pH met, chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.

6.11. Que cấy vòng, bằng platin-iridi hoặc niken-crom, đường kính khoảng 3 mm, hoặc loại vòng cấy dùng một lần.

7. Lấy mẫu

Lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp đối với sản phẩm tương ứng. Nếu không có các tiêu chuẩn như vậy thì các bên liên quan cần thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

...

...

...

Chuẩn bị mẫu theo TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể thì các bên liên quan thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

9. Cách tiến hành

9.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng

Chuẩn bị phần mẫu thử, huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng đầu tiên) và các dung dịch pha loãng tiếp theo TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra.

9.2. Cấy và ủ ấm mẫu

9.2.1. Chuẩn bị hai đĩa đối với sản phẩm dạng lỏng và/hoặc đối với mỗi bộ pha loãng đã chọn. Dùng pipet vô trùng (6.4) cho vào tâm của mỗi đĩa 1 ml của mẫu thử nếu là sản phẩm lỏng hoặc của các dung dịch pha loãng thích hợp. Sử dụng một pipet vô trùng cho mỗi dung dịch pha loãng.

9.2.2. Rót khoảng 15 ml môi trường VRBL (5.3) ở 44 °C đến 47 °C vào mỗi đĩa Petri. Thời gian tính từ khi kết thúc khâu chuẩn bị huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch pha loãng 1/10 nếu là sản phẩm lỏng) đến thời điểm rót môi trường vào đĩa không vượt quá 15 phút.

Trộn đều dịch cấy với môi trường và để cho hỗn hợp đông đặc lại bằng cách đặt đĩa Petri ở một mặt phẳng ngang, mát.

Đồng thời chuẩn bị một đĩa kiểm tra với 15 ml môi trường để kiểm tra độ vô trùng.

...

...

...

9.2.4. Lật ngược các đĩa đã cấy và để vào tủ ấm (6.2) ở 30 °C hoặc 37 °C (như thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h.

9.3. Đếm các khuẩn lạc

Sau thời gian ủ quy định (xem 9.2.4), nếu có thể, chọn các đĩa Petri có từ 10 khuẩn lạc trở lên đến 150 khuẩn lạc. Dùng thiết bị đếm khuẩn lạc (6.6) để đếm các khuẩn lạc màu đỏ ánh tía có đường kính 0,5 mm hoặc lớn hơn (đôi khi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh). Các khuẩn lạc này được coi là các coliform điển hình và không cần phải thử khẳng định tiếp.

Đối với các chi tiết về kỹ thuật đếm khuẩn lạc, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

Cũng đếm và khẳng định các khuẩn lạc điển hình (ví dụ kích cỡ nhỏ hơn), và tất cả các khuẩn lạc có nguồn gốc từ các sản phẩm sữa và có chứa đường không phải là lactoza, ngay sau khi ủ theo 9.4. Việc chuyển hóa đường không phải là đường lactoza có thể làm cho khuẩn lạc có hình dạng nhìn tương tự như coliform điển hình.

CHÚ THÍCH Vẻ bề ngoài của vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh các khuẩn lạc phụ thuộc vào loại coliform và chất lượng của môi trường.

9.4. Khẳng định

Cấy năm khuẩn lạc của từng loại không điển hình, nếu sẵn có, cho vào các ống nghiệm canh thang mật lactoza lục sáng (5.4). Ủ các ống nghiệm này trong tủ ấm (6.2) đặt ở 30 °C hoặc 37 °C (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h. Các ống Durham cho thấy có sinh khí thì được coi là có chứa Coliform. Lấy kết quả đếm trong phép tính (điều 10).

10. Biểu thị kết quả

...

...

...

11. Độ chụm

Căn cứ vào sự phân bố Poission của các vi sinh vật trong các chất nền, mà các giới hạn tin cậy của phương pháp này biến đổi theo số đếm các khuẩn lạc ± 16 % đến ± 52 % (xem Tài liệu tham khảo [3]). Trên thực tế , sai lệch này thậm chí còn lớn hơn. Trong các nghiên cứu cộng tác khác nhau, độ lệch chuẩn của độ lặp lại (s_r) là 0,20 log của các đơn vị, độ lệch chuẩn của độ tái lập (s_R) là 0,35 log của các đơn vị (xem Tài liệu tham khảo [4] và [5]).

Chi tiết hơn về các giới hạn tin cậy, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

- tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

...

...

...

- nếu độ lặp lại được kiểm tra, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 4882 (ISO 4831), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát hiện và định lượng coliform – Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất.

[2] EDWARD, P.R. and EWING, W.H. Identification of Enterobacteriaceae 3^rd edition, Burgess Publishing Company, Minneapolis, USA, 1972.

[3] COWELL and MORISETTI. J.Sci. Food Agric. 20, 1969, pp. 573.

[4] PITON and GRAPPIN. J. Assoc. Anal. Chem. 74, 1991, pp. 92-103.

[5] ALDRIDGE et al. Report of the Ministry of Agriculture, Fish and Food, Norwich, NR47UQ, 1993.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2007) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Coliform - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc