PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾM KHÍ

Meat and meat products. Enumeration of total aerobic bacteria

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm bề mặt sản phẩm và trong 1g cho các loại thịt và sản phẩm chế biến từ thịt trừ đồ hộp thịt.

1. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm²

1.1   Nguyên tắc

Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm², bề mặt sản phẩm được áp dụng để đánh giá độ nhiễm khuẩn trên bề mặt các sản phẩm thịt bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí có trên 1cm mẫu thử đã được chuyển tương đương với 1ml dung dịch huyền phù ban đầu dưới các điều kiện thử được xác định trong tiêu chuẩn này.

1.2   Lấy mấu theo TCVN 5153 – 90 và TCVN 4886 – 89.

1.3   Thiết bị và dụng cụ

-        Giấy thấm vô khuẩn, kích thước 2 x 2 hoặc 5 x 5 cm;

...

...

...

-        Bi thuỷ tinh vô khuẩn, có đường kính phù hợp;

-        Tăm bông;

-        Kẹp gắn kim loại;

-        Ống nghiệm 18 x 180mm;

-        Cốc đong các loại;

-        Bình tam giác các loại;

-        Bình định mức dung tích 100, 500 và 1000 ml;

-        Pipét 1,0 và 100ml, chia độ tới 0,1ml;

-        Đĩa petri có đường kính trong 90 – 100mm;

...

...

...

-        Tủ ấm điều chỉnh được ở 30 ± 1⁰C;

-        Tủ sấy khô;

-        Tủ hấp ướt;

-        Bếp cách thuỷ điều chỉnh được từ 30 đến 56⁰C;

-        Cân phân tích;

-        Máy đo pH;

-        Kính lúp phóng đại từ 3 đến 5 lần;

-        Hộp đếm khuẩn lạc;

-        Bếp điện;

...

...

...

1.4   Hoá chất và môi trường

1.4.1 Hoá chất

- Nước cất

- Natriclorua, tinh khiết phân tích (TKPT)

- Dinatri hydro phot phat (Na₂HPO₄), TKPT;

- Kalidihydro photphat (KH₂PO₄), TKPT;

- Thạch dùng cho vi sinh vật

- Trypton dùng cho vi sinh vật

- Glucaza.TKPT

...

...

...

- Pepton dùng cho vi sinh vật .

1.4.2 Môi trường

a) Nước muối sinh lý

- Thành phần: Natriclorua 8,5g;

- Nước cất, đủ 100ml;

- Cách pha chế:

Hoà tan muối trong nước, tiệt khuẩn trong nồi hấp ở 120⁰ C trong 15 phút.

b) Dung dịch đệm pepton

- Thành phần: Pepton 10g;

...

...

...

 Dinatrihydro phophat 9g;

 Kalidihydro phophat 1,5g;

 Nước cất, đủ 1000ml.

- Cách pha chế:

Đun sôi để hoà tan các chất trên, để nguội. Điều chỉnh độ pH bằng natrihydroxit 0,1N sao cho sau khi tiệt khuẩn pH ở 25⁰C là 7,0±0,2. Rót 100ml môi trường vào bình dung tích 250ml và 10 ml vào một ống nghiệm. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 120 ± 1⁰C trong 15 phút. Nếu không dùng ngay, môi trường cần được bảo quản nơi khô ráo, tối ở nhiệt độ từ 0 đến + 5⁰C và không quá 30 ngày.

c) Thạch trypten glucoza

- Thành phần: Trypton                                                               5g;

- Cao men                                                                               2,5g

- Glucoza                                                                                 1g

...

...

...

- Nước cất, đủ                                                                       100ml

- Cách pha chế:

Vừa đun nhỏ lửa vừa khuấy nhẹ để hoà tan các chất đến khi dung dịch sôi. Điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt trùng pH ở 25⁰ là 7,0 ± 0,2. Rót môi trường vào bình với lượng môi trường không quá 1/2 dung tích mỗi bình. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 120 ± 1⁰C trong 15 phút. Để nguội trong nồi cách thuỷ tới 45 ± 1⁰C để sử dụng. Nếu chưa dùng ngay cần bảo quản môi trường ở nơi khô ráo, tối, ở 0 đến + 5⁰ và không quá 30 ngày. Trước khi dùng, đun cách thuỷ cho chảy môi trường và để nguội trong nồi cách thuỷ tớ 45 ± 1⁰C^.

d) Thạch màng

- Thành phần: Thạch                                                             12 – 18g

- Nước cất, đủ                                                                       100ml

- Cách pha chế:

Vừa đun nhỏ lửa vừa khuấy nhẹ để hoà tan thạch đến khi sôi, điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn pH ở 25⁰C là 7,0 ± 0,2. Rót môi trường với lượng 4ml vào mỗi ống nghiệm và 100 ml vào mỗi bình tiệt khuẩn, sử dụng và bảo quản nôi trường như mục C.

1.5   Trình tự xác định

...

...

...

a) Dùng giấy thấm vô khuẩn (1.3) được làm ướt trước bằng nước muối sinh lý và có tổng diện tích là 100cm (gồm 4 mảnh 5 x 5 cm hoặc 25 mảnh 2 x 2 cm) dán lên các vị trí khác nhau của bề mặt mẫu (1.2) cần dám sao cho toàn bộ diện tích giấy thấm tiếp xúc trực tiếp với bề mặt mẫu. Sau 2 phút, chuyển toàn bộ số giấy thấm trên vào ống nghiệm đã chứa sẵn 10 ml dung dịch đệm pepton.

Có thể chuẩn bị mẫu theo cách: áp các khung kim loại vô khuẩn có kích thước tương tự (1.3) lên bề mặt mẫu ở các vị trí khác nhau với tổng diện tích là 100cm² ( 4 lần với khung 5 x 5 cm hoặc 25 lần với khung 2 x 2cm). Nhẹ nhàng quét đầu tăm bông đã được thấm ẩm bằng nước muối sinh lý lên toàn bộ diện tích đã được khung kim loại giới hạn. Cchuyển toàn bộ số lên đầu tăm bông trên vào ống nghiệm chữa sẵn 10ml dung dịch đệm pepton. Các ống nghiệm chứa mẫu có thể được bảo quản ở 0 đến + 2⁰ trong vòng 6h.

b) Chuyển toàn bộ lượng mẫu trong ống nghiệm vào bình tam giác dung tích 100 ml chứa khoảng 10 viên bi thuỷ tinh vô khuẩn. Tráng ống nghiệm chứa mẫu bằng dung dịch đệm pepton và đổ cả vào bình chứa mẫu, lắc nhẹ cho giấy thấm hoặc bông tan vụn, sau đó cho thêm dụch dịch đệm pepton tới khoảng 100ml

c) Để lắng hoặc tiến hành ly tâm dung dịch mẫu khoảng 5 phút ở tốc độ 200 vòng/ phút. Gạn lấy lớp dng dịch trong vào bình định mức dung tích 100ml và cho thêm dung dịch đệm pepton tới vạch mức 100ml (tương đương với 100cm² bề mặt mẫu được chuẩn bị). Dung dịch này được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu. Cần tiến hành kiểm tra ngay sau khi chuẩn bị xong dung dịch, nếu chưa kiểm tra, dung dịch cần được bảo quản ở 0 đến + 5⁰C nhưng không quá 1h.

1.5.2 Pha loãng mẫu

Dùng dung dịch đệm tepton ( mục b điều 1.4.2) để pha loãng dung dịch huyền phù ban đầu theo tỉ lệ 1/9 tới các độ pha loãng thập phân khác nhau (10^-1, 10^-2…10ⁿ). Cần căn cứ mức độ nhiễm khuẩn của mẫu để tiến hành pha loãng dung dịch mẫu tới các độ pha loãng phù hợp.

1.5.3 Tiến hành nuôi cấy

a) Với mỗi mẫu phải nuối cấy ít nhất 3 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng nuối cấy 2 đĩa, phải dùng pipet riêng trong mỗi độ pha loãng.

b) Dùng pipet khác nhau lấy 1 ml dung dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau cho vào giữa các đĩa petri. Rót vào mỗi đĩa khoảng 15 ml môi trường thạch trypton glucoza (mục c điều 1.4.2). Lắc vòng tròn 5 lần theo chiều kim đồng hồ và 5 lần ngược lai để trộn đều môi trường và dung dịch mẫu. Đặt các đĩa chứa môi trường trên mặt phẳng ngang sao cho môi trường đông tự nhiên. Thời gian từ khi pha loãng mẫu (1.5.2) đến khi nuôi cấy xong không quá 20 phút.

...

...

...

d) Khi môi trường đã đông, lật úp các đĩa peptri và đặt vào tủ ấm đã duy trì ở 30 ± 1⁰C trong 72 h.

1.6 Tính kết quả

1.6.1 Cứ sau 24h đếm sơ bộ số khuẩn lạc đã mọc và sau 72h đếm chính thức để tính kết quả.

Chỉ tính kết quả khi sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa là hợp lý với mối tương quan nghịch giữa độ pha loãng và số khuẩn lạc mọc trên đó.

Dùng mắt thường hoặc kính lúp để đếm số khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa petri, chỉ đếm những đĩa có số khuẩn lạc mọc riêng biệt và từ 15 đến 300 khuẩn lạc.

Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trong mỗi đĩa, trong trường hợp số lượng khuẩn lạc lớn và phân bố đều, có thể phần đáy đĩa theo đường kính thành các phần đều nhau có bội số là 2 để đếm một phần sau đó nhân kết quả với tổng số phần đã chia.

1.6.2 Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm² mẫu thử ( X­₁) được quy ra tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong 1ml dung dịch huyền phù ban đầu của mẫu thử được tính ở 2 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng gồm 2 đĩa theo công thức sau:

X₁ =

Trong đó:

...

...

...

n₁ - số lượng đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được đếm;

n_z - số lượng đĩa ở độ pha loãng thứ hai được đếm;

d - hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được đếm.

Kết quả được làm tròn tới số hàng nghìn và biều thị dưới dạng tích của một số thập phân hai chữ số ( 1,0 ….9,9) với 10ⁿ ( n= số chữ số nguyên của kết qủa trừ 1).

Thí dụ: Hai đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được đếm ( 10^-2) có số khuẩn lạc là 168 và 215;

Hai đĩa ở độ pha loãng liên tiếp thứ hai được đếm ( 10^-3) có số khuẩn lạc là 14 và 25.

X₁ =

Kết qủa 19182 được làm tròn thành 19000 và được biểu thị dưới dạng 1,9 x 10² khuẩn lạc/cm².

1.6.3 Nếu các đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp có số khuẩn lạc từ 15 đến 30, tính số khuẩn lạc của mỗi độ pha loãng và kết quả là trung bình số học của hai giá trị thu được. Lấy trường hợp tỷ số của giá trị cao so với giá trị thấp lớn hơn hai lấy giá trị thấp là kết quả.

...

...

...

1.6.5 Nếu hai đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu đều không có khuẩn lạc nào, kết quả là: ít hơn 1 vi khuẩn hiếu khí trên 1cm² bề mặt sản phẩm.

2. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1 g

2.1 Nguyên tắc

Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong 1 g mẫu được tính theo phương pháp đếm số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí quy ra 10ml dung dịch huyền phù ban đầu dưới các điều kiện xác định của tiêu chuẩn này.

2.2 Lấy mẫu, theo TCVN 5153 –90

2.3 Thiết bị và dụng cụ, xem điều 1.3

2.4 Hoá chất và môi trường, xem điều 1.4

2.5 Trình tự xác định

2.5.1 Chuẩn bị mẫu, theo TCVN 4887 – 89

...

...

...

2.5.2 Pha loãng mẫu, theo điều 1.5.2

2.5.3 Tiến hành nuôi cấy, theo các mục a, b, c điều 1.5.3

2.6 Tính kết quả

Cách đếm khuẩn lạc, tính toán và biểu thị kết quả theo các điều 1.6.1; 1.6.2 và 1.6.3.

2.6.1 Nếu 2 đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu đều có số khuẩn lạc thấp hơn 15, lấy trung bình số học m của chúng và kết quả X₂ được tính:

X₂ = m x

(d là hệ số pha loãng của dịch huyền phù ban đầu bằng 10^-1).

2.6.2 Nếu 2 đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu đều không có khuẩn lạc nào, kết quả X₂ được tính:

X₂< 1

...

...

...

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5667:1992 về thịt và sản phẩm thịt - phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếm khí