5. Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu cỏ khô, rơm rạ, thức ăn ủ chua, thức ăn xanh được cắt thành từng đoạn dài 1-3 cm. Thức ăn củ quả được cắt thành bản mỏng có độ dày 0,8 cm. Đảo đều mẫu đã cắt trên một mặt phẳng sạch và từ những chỗ khác nhau lấy một khối lượng mẫu để sao cho sau khi sấy có được khoảng 100 g. Sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ 60 - 65^oC đến khối lượng không đổi (trạng thái khô không khí), nghiền trên máy và sàng qua rây có đường kính lỗ rây 1mm. Phần còn lại trên rây được nghiền lại trong cối sứ, bổ sung vào phần đã sàng và trộn đều.

Mẫu thức ăn hỗn hợp, hạt ngũ cốc, khô dầu, bột từ thân lá cây xanh được nghiền nhỏ và sàng qua rây có đường kính lỗ rây là 1mm.

Mẫu đã chuẩn bị được bảo quản trong bình thủy tinh hay bình polyetylen có nút đậy kín, để ở nơi khô ráo và được sử dụng để tiến hành phân tích.

6. Tiến hành thử

6.1. Chiết hydrat cacbon hòa tan

Cân 0,5 g mẫu ở trạng thái khô không khí (theo mục 5) với độ chính xác đến 0,0002 g chuyển vào bình nón dung tích 150 - 200 ml. Rót vào bình 60 ml nước cất đã đun nóng đến 50 - 60^oC. Đặt bình vào máy lắc và tiến hành lắc với tần số 200 dao động/ phút trong thời gian 15- 20 phút

Lọc dung dịch qua phễu thuỷ tinh với giấy lọc mềm vào bình định mức dung tích 100 ml. Phần còn lại trên giấy lọc được rửa 2-3 lần bằng một lượng nước cất không nhiều. Sau khi làm lạnh đưa thể tích dung dịch đến vạch mức bằng nước cất và lắc đều. Dung dịch nhận được là phần nước chiết ban đầu của hydrat cacbon hòa tan

6.2. Thủy phân hydrat cacbon dễ thủy phân

...

...

...

Dịch chiết và dịch thủy phân có thể bảo quản trong tủ lạnh không quá một ngày.

6.3. Làm sáng màu dung dịch

Việc làm sáng màu dịch chiết (mục 6.1) và dịch thủy phân (mục 6.2) được tiến hành bằng cách hút 1-20 ml dung dịch (tùy theo hàm lượng đường) cho vào bình định mức dung tích 100 ml, rót thêm nước cất đến khoảng 2/3 thể tích bình và thêm tiếp 2 ml dung dịch kẽm sunfat hay kẽm axetat, 2ml dung dịch kali feroxianua. Dung dịch trong bình xuất hiện kết tủa vô định hình, thêm nước cất đến vạch mức, trộn đều và để yên trong 20 phút, thỉnh thoảng lắc đều. Sau đó lọc các dung dịch này qua giấy lọc vào bình định mức dung tích 100 ml, bỏ vài giọt đầu.

Nếu mẫu thử có hàm lượng hydrat cacbon thấp thì việc làm sáng màu được tiến hành trực tiếp với dịch chiết và dịch thuỷ phân đầu của mẫu thử mà không cần định mức chúng.

Các dung dịch đã làm sáng màu được bảo quản trong tủ lạnh không quá 1 ngày.

6.4. Tạo màu và đo độ quang

Việc tạo màu đối với dịch chiết, dịch thủy phân của mẫu thử cũng như đối với các dung dịch của thang chuẩn gluco được tiến hành trong các ống nghiệm chịu nhiệt có nút mài.

Dùng pipet với quả bóp cao su cho vào các ống nghiệm 10 ml thuốc thử antron. Sau đó, trong mỗi đợt phân tích thêm tiếp 2 ml dịch chiết đã làm sáng màu vào ống thứ nhất- 2 ml dịch thủy phân đã làm sáng màu vào ống thứ hai - 2 ml lần lượt các dung dịch chuẩn gluco vào ống thứ ba và ống tiếp theo. Đậy nút ống nghiệm lại, cẩn thận lắc đều. Các dung dịch phải trong suốt. Nếu dung dịch nhận được bị đục thì cần thêm tiếp cùng một lượng thuốc thử antron vào tất cả các ống nghiệm nhưng không vượt quá 15 ml cho mỗi ống. Nhanh chóng mở nút, cho các ống nghiệm vào giá kim loại và đặt vào nồi cách thủy đang sôi (nhất thiết phải đang sôi). Tiến hành đun sôi trong 20 phút, trong khi đun dung dịch trong các ống nghiệm xuất hiện màu xanh lá cây. Đậy nút ống nghiệm, làm lạnh dưới vòi nước và sau 30 phút đo mật độ quang của các dung dịch phân tích và dung dịch chuẩn trên máy so màu fek hay “spekol” ở bước sóng (625 ± 15) nm với cuvet có chiều dày 20 nm. Màu của dung dịch đo bền vững trong một ngày.

Dung dịch đối chứng là dung dịch của mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách thay 2 ml dung dịch chuẩn gluco bằng 2ml nước cất, thêm tiếp 10 hay 15 ml thuốc thử antron và đun sôi trong nồi cách thủy trong 20 phút cùng với mẫu phân tích.

...

...

...

Giá trị của mật độ quang đo được cần nằm trong khoảng 0,15-0,60. Nếu việc đo nhận được giá trị mật độ quang lớn hơn thì cần pha loãng dung dịch lấy để tạo màu và nếu nhận được giá trị thấp hơn thì cần tăng lượng mẫu thử đem phân tích.

7. Tính toán kết quả

7.1.       Hàm lượng hydrat cacbon hòa tan (đường) trong mẫu thử (X) biểu thị bằng % được tính theo công thức:

Trong đó:

n - Lượng đường trong dịch chiết được tính theo đồ thị chuẩn, tính bằng mg/ 2ml;

V- Thể tích ban đầu chưa làm sáng màu của dịch chiết, tính bằng ml;

V₁ - Thể tích dịch chiết đã làm sáng màu, tính bằng ml;

V₂ - Thể tích ban đầu của dịch chiết lấy để làm sáng màu, tính bằng ml;

...

...

...

m - Khối lượng mẫu thử, tính bằng mg;

100 - quy đổi ra tỷ lệ phần trăm.

7.2. Hàm lượng hydrat cacbon để thủy phân (tinh bột) trong mẫu thử (X₁) biểu thị bằng % được tính theo công thức:

Trong đó:

n - Lượng đường trong dịch thủy phân được tính theo đồ thị chuẩn, tính bằng mg/ 2ml;

 V- Thể tích ban đầu chưa làm sáng màu của dịch thủy phân, tính bằng ml;

V₁ - Thể tích dịch thủy phân đã làm sáng màu, tính bằng ml;

V₂ - Thể tích ban đầu của dịch thủy phân lấy để làm sáng màu, tính bằng ml;

...

...

...

m - Khối lượng mẫu thử, tính bằng mg;

100 - Quy đổi ra tỷ lệ phần trăm;

0,9 - Hệ số chuyển lượng gluco ra tinh bột.

7.3. Kết quả cuối cùng là trị số trung bình của hai lần xác định song song. Sự sai khác cho phép giữa hai lần xác định song song phụ thuộc vào hàm lượng hydrat cacbon có trong mẫu và không được vượt quá trị số nêu ra trong bảng 2. 

Bảng 2

Hàm lượng hydrat cacbon

Sư sai khác cho phép giữa hai lần xác định song song

1-6,0

0,50

...

...

...

0,80

12,1-25,0

1,20

25,1-45,0

2,00

45,1-75,0

3,30

7.4. Hàm lượng hydrat cacbon hòa tan hay hydrat cacbon để thủy phân (X₂) biểu thị bằng % ở dạng vật chất khô được tính theo công thức:

 hay

...

...

...

X hay X₁ - lượng hydrat cacbon hòa tan hay để thủy phân trong mẫu thử ở dạng khô không khí, tính bằng %;

W - độ ẩm của mẫu thử, tính bằng %.

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5285:1990 về thức ăn chăn nuôi - Phương pháp xác định hàm lượng hydrat cacbon hòa tan và dễ thủy phân bằng thuốc thử antron