7. Tính toán kết quả

7.1. Dùng kính hiển vi huỳnh quang đặt trong buồng tối, đọc kết quả các mẫu đối chứng trước, mẫu kiểm nghiệm sau.

Chung cho cả 2 phương pháp:

- Trên mẫu D (kiểm tra tế bào) không có hoặc có rất ít những điểm phát quang giả màu xanh nâu.

- Trên mẫu C (đối chứng dương tính): Có nhiều tế bào hoặc đám tế bào phát quang màu vàng xanh, trải đều trong nguyên chất, chung quanh tế bào có màu sáng, lượng phát quang tỉ lệ thuận với số lượng virút, riêng phương pháp nhuộm gián tiếp cho kết quả rõ hơn (sáng trên nền xanh Evans).

- Trên mẫu B (đối chứng ức chế đặc hiệu) như mẫu D.

- Trên mẫu A: Nếu kết quả đọc được như mẫu C là dương tính và ngược lại là âm tính.

7.2. Kết luận chung cho cả hai phương pháp.

Mẫu thử A

...

...

...

Mẫu thử C

Mẫu thử D

Kết luận

+

-

+

-

Có virút dịch tả lợn

+

...

...

...

+

-

Sai sót kỹ thuật (làm lại)

-

-

+

-

Không có virút dịch tả lợn

...

...

...

Hoá chất, thuốc nhuộm, môi trường tế bào thận lợn.

A. Dùng rửa tiêu bản và pha loãng conjugat kháng thể huỳnh quang (nhuộm gián tiếp).

A1. Dung dịch đệm muối photphat pH 7,0.

A1.1. Dung dịch 1

- Natri dihydrophotphat (NaH2PO4)

14g

- Nước cất 2 lần (trung tính)

...

...

...

A1.2. Dung dịch 2.

- Natri dihydrophotphat (NaH2PO4.12H2O)

35,85g

- Nước cất hai lần (trung tính)

1.000ml

A1.3 Dung dịch hoàn chỉnh

- Dung dịch 1

...

...

...

- Dung dịch 2

61ml

- Natri clorua (NaCl)

8,77g

- Nước cất 2 lần (trung tính)

900ml

Hấp 121^oC trong 30 phút. Bảo quản 4^oC.

A2. Dung dịch xanh evans.

...

...

...

- Xanh evans

0,25g

- Nước cất 2 lần (trung tính)

100ml

Hấp 113^oC trong 10 - 15 phút. Bảo quản 4^oC.

A3. Dung dịch đệm Tris pH 8,6.

- Tris, dung dịch 2,42% trong nước

...

...

...

- Axit clohydric, dung dịch 0,2N (HCl)

6,1ml

- Nước cất 2 lần (trung tính) vừa đủ

100ml

Lọc vô khuẩn. Bảo quản ở 4^oC.

Ghi chú: Axit clohydric, dung dịch 0,2N (HCl).

- Axit clohydric đậm đặc

...

...

...

- Nước cất 2 lần (trung tính)

98ml

Hấp 121^oC trng 15 phút.

B. Dùng chế môi trường và xử lý mẫu thử trước khi cấy.

B1. Natri hydro cacbonat, dung dịch 1,4% hoặc 7% (NaHCO3).

- Natri hydro cacbonat                                                                    1,4g hoặc 7g

- Nước cất 2 lần (trung tính)                                                             100ml.

Lọc Seitz. Bảo quản 4^oC.

B2. Dung dịch đỏ phenol (Phenol red).

...

...

...

- Natri hydroxit, dung dịch 0,1N trong nước (khoảng)                       10-12ml

- Nước cất 2 lần (trung tính) vừa đủ                                                 100ml

Nghiền đỏ phenol trong cối sứ, nhỏ dần dung dịch Natri hydroxit vào cho đến khi đỏ phenol tan hoàn toàn, sau đó bổ sung nước cất hai lần vừa đủ 100ml. Hấp 121^oC trong 30 phút (nếu cần thì chỉnh pH 7,0 bằng Natri hydroxit dung dịch 0,05N trước khi hấp.

Ghi chú: Natri hydroxit dung dịch 0,1N hoặc 0,05N.

- Natri hydroxit                                                                               2g hoặc 1g

- Nước cất 2 lần (trung tính)                                                             100ml

B3. Kháng khuẩn tố, dung dịch có 20.000 đơn vị Penicillin và Streptomycin trong 1ml nước.

- Penicillin (bột để tiêm)                                                                  2.000.000 đơn vị.

- Streptomycin (bột để tiêm)                                                           2.000.000 đơn vị.

...

...

...

Bảo quản -20^oC.

B4. Dung dịch muối điện giải Henks

B4.1. Dung dịch 1

- Natri clorua (NaCl)                                                                         160g

- Kali clorua (KCl)                                                                            8g

- Magiê sulphat (MgSO4.7H2O)                                                        4g

- Canxi clorua (CaCl2)                                                                      2,8g

- Nước cất 2 lần (trung tính)                                                              1.000ml

Cho thêm clorofooc 2ml. Bảo quản 4^oC.

...

...

...

- Natri hydro photphat (NaH2PO4.12H2O)                                           3,04g

- Katri dihydro photphat (KH2PO4)                                                     1,00g

- Clucose                                                                                          20g

- Dung dịch đỏ phenol (B2)                                                               100ml

- Nước cất 2 lần (trung tính)                                                                1.000ml

Cho thêm clorofooc 2ml. Bảo quản 4^oC. B4.3. Dung dịch hoàn chỉnh.

- Dung dịch 1                                                                                     50ml

- Dung dịch 2                                                                                     50ml

- Nước cất 2 lần (trung tính)                                                                 900ml

...

...

...

Khi dùng cho thêm Natri hydro cacbonat, dung dịch 1,4% (B1): 2,5ml.

B5. Dung dịch Trypsin.

- Trypsin                                                                                            1g

- Dung dịch Hanks (B4,3)                                                                    100ml

Lắc nhẹ cho tan đều. Để ở 4^oC từ 12-18 giờ, để tiếp trong nồi chưng cách thuỷ ở 37^oC trong 3 phút cho trypsin tan hoàn toàn. Lọc vô khuẩn bằng phễu thuỷ tinh xốp. Cho thêm dung dịch kháng khuẩn tố (B3) 1ml. Chia vào các lọ nhỏ. Bảo quản -20^oC. Khi dùng pha loãng tiếp thành đậm độ 0,25%.

B6. Dung dịch hydrolysat lactabumin.

- Hydrolysat lactabumin                                                                      5g

- Dung dịch Hanks (B4.3)                                                                    1.000ml

Hấp 121^oC trong 10 phút. Bảo quản 4^oC.

...

...

...

- Dung dịch Hanks (B4.3)                                                                     100ml

- Dung dịch kháng khuẩn tố (B3)

+ Để xử lý mẫu thử:                                                                             2ml

+ Để pha loãng mẫu thử (10^-1) và rửa tế bào                                         1ml

B8. Dung dịch đậm Versen;

- Natri clorua                                                                                        8g

- Kali clorua                                                                                         0,2g

- Natri hydro photphat (NaHPO4.2H2O)                                                 0,41g

- Versen                                                                                              0,2g

...

...

...

- Nước cất 2 lần (trung tính)                                                                   1.000ml

Hoà tan. Lọc vô khuẩn. Bảo quản 4^oC.

C. Môi trường nuôi tê bào.

C1. Môi trường Eagle cần thiết cho các tế bào sinh trưởng (MEM-G).

- Dung dịch hydrolysat lactabumin (B6)                                                 90ml.

- Dung dịch kháng khuẩn tố Penicillin và Streptomycin (B3)                   1ml.

Điều chỉnh pH 7,2 bằng Natri hydro cacbonat, dung dịch 7% (B1).

- Huyết thành bê sơ sinh 10ml.

Bằng thao tác vô khuẩn trộn đều, chia vào các bình tam giác 50ml. Dùng để nuôi cấy tế bào thận lợn.

...

...

...

Thành phần như C1, chỉ khác là dùng 1ml huyết thanh bê sơ sinh thay cho 10ml. Dùng cấy mẫu thử (phân lập virút dịch tả lợn).

D. Kỹ thuật sản xuất tế bào thận lợn.

D1. Chọn tế bào: Dùng tế bào thận lợn sơ sinh, khoẻ mạnh, không có bệnh.

D2. Tách tế bào bằng dung dịch Trypsin (B5) dưới tác động của máy khuấy từ.

D3. Loại bỏ Trypsin và thu gom tế bào bằng máy ly tâm.

D4. Pha mẫu bằng MEM-G. Đếm số tế bào bằng buồng đếm bạch huyết cầu dưới kính hiển vi thông thường.

D5. Tính số lượng tế bào cần thiết để định tỷ lệ pha loãng bằng MEM-G (yêu cầu 50.000 tế bào/1ml môi trường).

D6. Chia vào các ống leighton có ghép lá kính, mỗi ống 2ml, ủ 37^oC từ 24-72 giờ. Khi tế bào đã sinh trưởng và phủ kín trên bề mặt lá kính thì cấy mẫu thử (theo 6.3.2).

Ghi chú: Nếu sử dụng tế bào dòng thì pha chế theo chỉ dẫn của nơi sản xuất, nếu chuyển tiếp tế bào dòng thì dùng dung dịch versen (B8) để làm bong lớp tế bào rồi dùng dùng dịch trypsin (B5) tách tế bào và làm tiếp theo phụ lục D2 đến D6.

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5157:1990 về thịt và sản phẩm của thịt - phương pháp phát hiện virut dịch tả lợn do Ủy ban Khoa học Nhà nước ban hành