Để kiểm tra tính ổn định của hệ thống sắc ký, bơm vài lần dung dịch chuẩn (4.11.3) chứa 1,0 µg/ml vào hệ thống cho đến khi đạt được độ ổn định của diện tích các pic và thời gian lưu. Khi thực hiện ở các điều kiện nêu trên tách được maduramicin ra khỏi các ionophore như salinomycin, narasin, monensin và semduramycin với đường nền.

8.3.2  Dựng đường chuẩn

Bơm mỗi dung dịch chuẩn (4.11.3) vài lần vào hệ sắc ký và xác định giá trị trung bình của diện tích các pic đối với mỗi nồng độ. Dựng đường chuẩn với trục tung là giá trị trung bình của diện tích các pic của các dung dịch chuẩn và trục hoành là nồng độ tương ứng, µg/ml, của dung dịch chuẩn.

8.3.3  Dung dịch mẫu thử

Bơm mẫu đã chiết (8.2) ít nhất 2 lần vào hệ sắc ký, thể tích mẫu bơm tương tự như thể tích dung dịch chuẩn và xác định giá trị trung bình diện tích pic maduramicin.

9  Tính kết quả

Từ giá trị trung bình diện tích pic maduramicin của mẫu thử, xác định nồng độ trong dung dịch mẫu thử, µg/ml, tìm giá trị tương ứng trên đường chuẩn (8.3.2).

Sử dụng công thức sau đây để tính hàm lượng maduramicin (w_m) trong mẫu, tính bằng mg/kg.

...

...

...

ρ_m  là nồng độ khối lượng của maduramicin trong dịch chiết mẫu (8.2), tính bằng µg/ml;

m  là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam;

f_d  là hệ số pha loãng theo (8.2).

10  Khẳng định dữ liệu

Việc nhận biết maduramicin có thể được khẳng định bằng phương pháp đồng sắc ký. Dịch chiết mẫu (8.2) được thêm chuẩn bằng cách bổ sung một lượng nhất định dung dịch chuẩn. Lượng maduramicin bổ sung này phải tương đương với lượng maduramicin được tìm thấy trong dịch chiết mẫu. Chỉ có chiều cao của pic maduramicin tăng cao sau khi tính cả lượng đã thêm vào và cả dịch chiết mẫu. Chiều rộng của pic tại nửa chiều cao của pic phải nằm trong khoảng ± 10 % so với chiều rộng ban đầu của pic maduramicin của dịch chiết mẫu khi chưa được thêm chuẩn.

11  Độ chụm

11.1  Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về phương pháp này được tóm tắt trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ nghiên cứu cộng tác này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã cho.

11.2  Độ lặp lại

...

...

...

11.3  Độ tái lập

Sự khác biệt tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, thu được bằng cách sử dụng cùng một phương pháp trên cùng một chất liệu thử nghiệm trong các phòng thí nghiệm khác nhau với các người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

12  Báo cáo kết quả thử nghiệm

Báo cáo kết quả thử nghiệm phải ghi rõ:

a) Thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) Phương pháp lấy mẫu được sử dụng, nếu biết;

c) Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) Kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng được;

e) Mọi chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tùy chọn, cùng với các chi tiết về sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

...

...

...

Phụ lục A

(tham khảo)

Kết quả nghiên cứu liên phòng thí nghiệm

Nghiên cứu liên phòng thí nghiệm của Châu Âu gồm 10 phòng thí nghiệm ở 9 quốc gia được thực hiện trên 5 mẫu khác nhau:

Mẫu A: thức ăn cho gà thịt, 4 % chất béo, hàm lượng maduramicin 2,5 mg/kg

Mẫu B: thức ăn cho gà thịt, 8 % chất béo, hàm lượng maduramicin 4,5 mg/kg

Mẫu C: thức ăn cho gà tây, hàm lượng maduramicin 5 mg/kg

Mẫu D: thức ăn cho gà thịt, 4 % chất béo, hàm lượng maduramicin 9 mg/kg

Mẫu E: Premix cho gà thịt, hàm lượng maduramicin 450 mg/kg

...

...

...

CHÚ THÍCH 2: Thức ăn của gà tây chứa lúa mì, ngô, khô đậu nành ép, hạt cải, đậu Hà Lan, protein khoai tây và mỡ lợn công nghiệp.

Phép thử nghiệm này được Viện Kiểm định Chất lượng Sản phẩm Nông nghiệp của Hà Lan (RIKILT) tổ chức thực hiện năm 2002 và các kết quả thu đã được phân tích thống kê theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) để cung cấp dữ liệu chính xác nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thí nghiệm đối với maduramicin

Các chỉ tiêu

Mẫu

A

B

C

D

...

...

...

Số lượng phòng thí nghiệm tham gia

10

10

10

10

10

Số lượng phòng thí nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

10

10

...

...

...

10

9

Số lượng kết quả thử nghiệm từ các phòng thí nghiệm giữ lại

20

20

18

20

17

Giá trị trung bình maduramicin, mg/kg

...

...

...

4,44

5,05

9,37

464

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/kg

0,22

0,36

0,17

0,58

...

...

...

Hệ số biến thiên lặp lại, Cv_r, %

8,53

8,19

3,29

6,18

3,15

Giới hạn lặp lại r (2,8 x s_r), mg/kg

0,63

1,02

...

...

...

1,62

40,9

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/kg

0,40

1,13

0,81

1,57

52,9

Hệ số biến thiên tái lập, Cv_R %

...

...

...

25,4

16,1

16,8

11,4

Giới hạn tái lập R (2,8 x s_R), mg/kg

1,12

3,16

2,28

4,41

...

...

...

Giá trị HorRat^a

1,10

1,98

1,29

1,47

1,80

HorRat là hệ số giữa RSD_R được xác lập và RSD_R dự đoán trước

Phụ lục B

...

...

...

Điều kiện để tạo dẫn xuất sau cột với DMAB

B.1  Thuốc thử

B.1.1  Metanol, CH₃OH, dùng cho HPLC

B.1.2  Axit sulfuric, H₂SO₄, 95 % đến 97 %

B.1.3  4-(dimetylamino) benzaldehyd, DMAB, C₉H₁₁NO

B.1.4  Metanol - axit sulfuric

Lấy 40 ml axit sulfuric (B.1.2) khuấy cẩn thận vào 950 ml metanol (B.1.1). Khử bọt khí dung dịch trong bể siêu âm (5.2) trong 15 min trước khi sử dụng.

B.1.5  Dung dịch DMAB

Hòa tan 60,0 g 4-(dimetylamino) benzaldehyd (B.1.3) trong 950 ml metanol (B.1.1). Khử bọt khí dung dịch trong bể siêu âm (5.2) trong 15 min trước khi sử dụng.

...

...

...

B.2.1  Bộ phản ứng sau cột (một bơm kép hoặc hai máy bơm đơn) có buồng trộn, cuộn phản ứng bằng vật liệu trơ (ví dụ Teflon® hoặc Peek®) để hoạt động ở 95 °C, dài 7,0 m với đường kính trong 0,33 mm và buồng phản ứng hoặc lò phản ứng hoạt động ở 95 °C.

Tốc độ hỗn hợp metanol-axit sulfuric (B.1.4):

0,4 ml/min.

Lưu lượng của dung dịch DMAB (B.1.5):

0,4 ml/min.

Nhiệt độ phản ứng sau cột:

95 °C.

Detector VIS lắp sau phản ứng sau cột:

600 nm.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Nếu chỉ có một máy bơm sử dụng cho phản ứng sau cột, thì các thuốc thử B.1.4 và B.1.5 có thể được trộn lẫn với nhau tỷ lệ (1/1 thể tích). Vì DMAB sẽ bị oxy hóa nhanh làm cho dung dịch bị tối màu, nên dung dịch phải được bảo vệ tránh ánh sáng trong bồn nước đá và phải được sử dụng trong vòng 24 h.

B.3  Các điều kiện khác

Các điều kiện khác không thay đổi so với việc sử dụng thuốc thử vanillin (xem 5.3.5 và 8.3.1).

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] J.J.M. Driessen, M.J.H. Tomassen and J. de Jong, CANFAS - Collaborative study for the determination of maduramicin in feedingstuffs and premixtures by HPLC, Report 2002.016, State Institute for Quality Control of Agricultural Products (RIKILT), 2002

[2] EU project 'Development and validation of HPLC methods for the official control of coccidiostats and antibiotics used as feed additives', CANFAS-SMT4-CT98-2216

[3] Jacob de Jong et al., Determination of maduramicin in feedingstuffs and premixtures by liquid chromatography: Development, validation, and interlaboratory study, J. of AOAC Int., 87, 5, 1033 -1041, 2004

...

...

...

[5] ISO 6498, Animal feeding stuffs - Preparation of test samµles

[6] ISO 5725 (all parts), Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12602:2018 (EN 15781:2009) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định maduramincin - Ammonium bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo có tạo dẫn xuất sau cột