5. Lựa chọn phương pháp

Phương pháp luận và marker được sử dụng để nhận biết giống phải đáng tin cậy và thực tế cho phép mỗi phòng thử nghiệm ghi chú lại các sơ đồ marker đơn giản và có độ tin cậy nhất.

Việc lựa chọn này yêu cầu áp dụng các tiêu chí chất lượng, như trong việc chọn các alen đối chứng và hệ thống phát hiện/ghi lại alen; hệ thống phát hiện phải thích hợp với kích thước của các sản phẩm PCR.

Các phương pháp được sử dụng cần được chọn theo marker sẵn có đối với từng loài được nghiên cứu.

Dưới đây là danh mục tiêu chí quan trọng nhất để chọn phương pháp luận:

a) tính sẵn có;

b) độ tái lập của dữ liệu được đưa ra giữa các phòng thử nghiệm và nền tảng phát hiện (các loại thiết bị được dùng);

c) độ lặp lại;

d) khả năng phân biệt

...

...

...

6.1. Tiêu chí chung

Tiêu chí chung để chọn bộ marker là:

a) mức độ phân biệt dựa theo các giống đối chứng;

b) biến động về độ lặp lại và độ tái lập của bộ marker trong phòng thử nghiệm (xem 8.2.1 và 8.2.2);

c) tránh càng xa càng tốt các marker đưa ra các alen bất hoạt;

d) sự thuận tiện để ghi (scoring).

6.2. Chọn bộ marker

Để khẳng định việc nhận biết khi so sánh với một hoặc nhiều đối chứng (dòng bố mẹ, lai nhân tạo, vô tính), phòng thử nghiệm phải sử dụng bộ marker tạo ra số lượng đủ phân biệt của các alen để đáp ứng yêu cầu của khách hàng. Phòng thử nghiệm phải nêu rõ lý do bộ marker được chọn.

Các bộ marker cần được phân bố khắp toàn bộ gen khi sơ đồ liên kết sẵn có. Mặc dù đây không phải là điều bắt buộc, nhưng rất bổ ích để hướng dẫn tránh việc chọn đối với các marker có khả năng liên quan.

...

...

...

Phép phân tích SSR đầy đủ và có hiệu quả khi chọn các marker chất lượng cao. Việc chọn marker do đó cần như sau:

a) phải ưu tiên cho các marker hiển thị ít hoặc không có các băng vạch giả;

b) việc chọn các marker phải tính đến hệ thống tách và quan sát;

c) phải ưu tiên các marker không có mặt alen cạnh tranh và cần cố gắng để loại bỏ bất kỳ sự cạnh tranh giữa các marker trong các lần chạy PCR đa thành phần.

6.4. Nucleotid lặp lại đơn lẻ (SNP)

Phải tránh các vùng lặp lại.

CHÚ THÍCH: Các vùng lặp lại có thể dẫn đến các alen SNP chiếm ưu thế nếu xuất hiện việc phát hiện đồng thời vùng tương đồng.

Bản chất của các SNP là chúng có hai trạng thái alen. Không nên chọn các SNP có nhiều hơn hai trạng thái alen.

Các SNP có thể được ghi lại đáng tin cậy và không phức tạp. Nên để phân tích một số lượng lớn các marker độc lập hoặc thông qua việc ghép để đạt được khả năng phân biệt tốt giữa các giống.

...

...

...

7.1. Mẫu

Cỡ mẫu và các điều kiện bảo quản trước khi phân tích phải phù hợp với phép phân tích được yêu cầu.

Cần chú ý về việc nhận biết mẫu, mẫu con và phần mẫu thử, theo quy định trong 5.8.2 của TCVN ISO/IEC 17025:2005 để đảm bảo việc truy xuất nguồn gốc.

7.2. Cỡ mẫu

Để phân tích chất chuẩn, cần bao gồm một lượng đủ các mẫu riêng lẻ để đặc trưng cho đa hình thái giống nội, có tính đến các đặc tính tái lập (xem 7.3) và sự hiểu biết khác của các yếu tố đặc thù của giống và/hoặc trồng trọt. Đối với các mẫu thử, khi có thể, nên phân tích vài mẫu riêng lẻ hoặc nhiều mẫu chung.

7.3. Mẫu đối chứng

Phải sử dụng mẫu đối chứng (xem 3.5.1) được xử lý theo cùng một phương pháp như đối với mẫu thử. Nếu mẫu đối chứng là khuôn mẫu ADN, thì thực hiện các bước tương tự sau khi tách ADN.

Sơ đồ phân tử thu được trước trong các điều kiện tương tự như áp dụng cho sơ đồ phân tử đối chứng.

Các sơ đồ marker của mẫu đối chứng có thể được sử dụng để xây dựng cơ sở dữ liệu trong mỗi phòng thử nghiệm và sau đó được sử dụng cho các phép phân tích thông dụng.

...

...

...

- Các giống tự giao hoặc tự giao ban đầu (primarily autogamous varieties or primarily autogamous varieties): các giống tự giao hoặc tự giao ban đầu không nhất thiết phải đơn hình tại tất cả các locus, kể cả locus SSR hoặc locus SNP. Thông thường nên phân tích một số hạt hoặc cây riêng lẻ để đặc trưng cho tính đa dạng trong một giống cây trồng. Tuy nhiên, một lượng lớn các mẫu riêng lẻ có thể được sử dụng để đại diện cho giống.

- Các giống trong một quần thể: nên phân tích các hạt hoặc các cây riêng rẽ để xác định sơ đồ tần số alen đặc trưng cho mỗi giống trong quần thể. Phải sử dụng cỡ mẫu đại diện cũng như cách tiếp cận thống kê để xác định mức độ tin cậy của các kết quả phù hợp với 9.4. Trong trường hợp này, phải sử dụng mẫu đối chứng cho mỗi giống trong quần thể.

- Lai đơn cố định bố mẹ (F1): về nguyên tắc, có thể phân tích chỉ một cá thể tương tự cho tất cả các cá thể. Có thể không đồng nhất, ví dụ: từ dị hợp tử còn lại của ít nhất một dòng bố mẹ, sự thụ phấn chéo hoặc trộn lẫn về vật lý. Do đó, việc hướng dẫn là phân tích vài cá thể để đại diện sơ đồ ADN của giống xác định.

- Lai ba (3-way hybrids): Cấu trúc gen của loại lai này cho thấy ba loài khác nhau lai nhau cần thực hiện các phép phân tích trộn hỗn hợp của một số lượng cá thể thích hợp (ít nhất là 20).

- Giao phối cùng giống hoặc các giống giao phối cùng giống chính: Nên phân tích một lượng hạt hoặc cây trồng riêng lẻ để đặc trưng cho tính đa hình mà có thể có trong giao phối cùng giống hoặc giao phối cùng giống chính. Tuy nhiên, mẫu chung của các cá thể cũng có thể được sử dụng để đại diện cho giống.

8. Đánh giá xác nhận phòng thử nghiệm

8.1. Yêu cầu chung

Mỗi phòng thử nghiệm sử dụng phương pháp đã được xác nhận bằng nghiên cứu liên phòng hoặc không thì bằng nghiên cứu nội bộ phòng thử nghiệm.

Trong lĩnh vực nhận biết giống marker phân tử trung gian, việc đánh giá phương pháp tương đương với đánh giá xác nhận bộ marker.

...

...

...

Bộ marker phải cung cấp đủ khả năng phân biệt đáp ứng yêu cầu của khách hàng. Phương pháp được đánh giá xác nhận qua toàn bộ quá trình phân tích (trên từng nền mẫu của mỗi loài).

8.2. Tiêu chí đánh giá xác nhận nội bộ phòng thử nghiệm

Việc đánh giá xác nhận bao trùm bộ marker được chọn bởi phòng thử nghiệm theo các tiêu chí nêu trong Điều 6.

Việc đánh giá xác nhận phải bao gồm một số lượng thích hợp các giống khác nhau (ít nhất là năm, nếu có thể).

Đối với các loài có mặt các giống lai thì nên sàng lọc alen cạnh tranh sử dụng các dị hợp tử (cây lai hoặc hỗn hợp ADN bố mẹ) và các dòng bố mẹ, nếu có thể.

8.2.1. Độ lặp lại

Mỗi marker được sử dụng phải cho độ lặp lại. Mục đích là để kiểm tra độ chụm trong các điều kiện giống nhau.

Mỗi marker phải được kiểm tra về độ lặp lại trên một lần chiết axit nucleic cho mỗi giống và ba PCR cho mỗi lần chiết.

Marker được coi là lặp lại nếu ba kết quả giống nhau cho mỗi giống được kiểm tra.

...

...

...

Mỗi marker được sử dụng phải cho độ tái lập. Mục đích là để kiểm tra độ chụm trong các điều kiện khác nhau.

Mỗi marker được kiểm tra về độ tái lập bằng cách cho chạy ba phép thử không đồng thời cho mỗi giống, với một PCR cho ADN chiết được. Mỗi phép thử cần có một số lượng đủ các cá thể riêng lẻ hoặc nhiều cá thể trên mỗi giống để công nhận giống nội lặp lại. Các giống đã biết có các biến thể không bình thường cần loại ra khỏi các phép thử tái lập.

Không đồng thời có nghĩa là mỗi phép thử phải được thực hiện các điều kiện khác nhau (người thực hiện, thiết bị, thời gian, thuốc thử v.v...).

Marker được coi là tái lập nếu cho các kết quả giống nhau cho mỗi giống qua ba phép thử.

8.2.3. Phân biệt

Việc sử dụng bộ marker đã đánh giá xác nhận được giới hạn đến các giống có thể phân biệt được.

Có một số trường hợp các giống thu được từ các nhà sản xuất, như chọn lọc tự nhiên hoặc đột biến gây ra hoặc lai lặp lại thì có thể không phân biệt được từ giống ban đầu khi sử dụng một bộ marker cho tất cả các mục đích. Trong những trường hợp này có thể cần đến các bộ marker bổ sung đặc hiệu hoặc biện pháp bổ sung khác để nhận biết rõ các giống. Những hạn chế đã biết của bộ marker phải được hiểu rõ.

8.2.4. Đánh giá xác nhận khi thay đổi thiết bị hoặc nền mẫu thực vật

CHÚ THÍCH: Thiết bị bao gồm chu trình nhiệt, pipet tự động, hệ thống tách và phát hiện.

...

...

...

Mỗi marker được thử nghiệm qua 1 PCR trên 1 ADN trên ít nhất năm giống khác nhau, nếu có thể.

Cho dù có những khác nhau về các thông số, như kích thước alen suy ra được khi xác định bằng các bộ thiết bị khác nhau, thì các kết luận được rút ra đối với việc nhận biết giống không được thay đổi.

8.3. Các tiêu chí đánh giá liên phòng thử nghiệm

8.3.1. Yêu cầu chung

Việc đánh giá xác nhận chỉ liên quan đến kết quả. Mỗi phòng thử nghiệm tham gia tự do lựa chọn quy trình phân tích (chiết ADN, tinh sạch axit nucleic, cách thức PCR, thiết bị v.v...) trong quá trình thử nghiệm đánh giá liên phòng. Việc tự do lựa chọn này không áp dụng cho việc sử dụng marker.

8.3.2. Đánh giá xác nhận bằng phép thử nghiệm liên phòng

8.3.2.1. Yêu cầu chung

Đánh giá xác nhận bằng phép thử nghiệm liên phòng này phải xác định tiếp quy trình lựa chọn bộ marker mạnh nhất có thể trong số các marker được đánh giá trong quá trình đánh giá nội bộ phòng trước đó (xem 8.2).

8.3.2.2. Số lượng tối thiểu các phòng thử nghiệm tham gia

...

...

...

8.3.2.3. Vật liệu sinh học

Phép thử phải thực hiện trên một lượng đủ các giống (ít nhất là năm, nếu có thể) khi thực hiện đánh giá ở mức quốc gia (hoặc quốc tế). Số lượng cá thể hoặc các cá thể trên mỗi giống được kiểm tra trên mỗi phòng thử nghiệm tham gia cần đủ để công nhận sự đa hình của giống nội. Các giống được biết có các biến thể bất thường không được đưa vào sử dụng trong phép thử đánh giá liên phòng.

CHÚ THÍCH: Vật liệu sinh học có thể là hạt, tế bào thực vật, bột. Nếu sử dụng bột, thì bột phải có xuất xứ từ một giống.

8.3.2.4. Nguyên tắc làm việc

Nguyên tắc làm việc, bao gồm cả các yêu cầu cơ bản đối với PCR, như mồi và trình tự dò, kể cả chất nhuộm màu huỳnh quang, chất làm tắt, chất gắn kết rãnh nhỏ và/hoặc các phần thúc đẩy đặc hiệu khác, cũng như các điều kiện khuếch đại PCR được khuyến cáo, phải được cung cấp.

Các phòng thử nghiệm tham gia có thể điều chỉnh các điều kiện này cho thích hợp với thiết bị được sử dụng. Việc bổ sung hoặc loại bớt sự mở rộng trình tự mồi 5’ hoặc thay đổi các chất nhuộm màu huỳnh quang là cho phép; tuy nhiên không được thay đổi đoạn trình tự mồi đặc hiệu đối với trình tự đích.

8.3.2.5. Chú thích về các kết quả

Xem 9.2.

8.3.2.6. Đánh giá xác nhận các marker riêng rẽ

...

...

...

Đối với các marker vệ tinh nhỏ, các kích thước tương đối của alen đối với bộ giống đã cho phải thống nhất giữa các phòng thử nghiệm.

8.3.2.7. Đánh giá xác nhận phương pháp của phòng thử nghiệm

Phương pháp được đánh giá xác nhận khi một lượng đủ các marker tái lập thu được. Phòng thử nghiệm phải xác định số lượng đủ các marker. Số lượng marker phụ thuộc vào kiểu marker được sử dụng, các loài và việc ứng dụng.

Cần đánh giá phương pháp với hệ thống phát hiện được sử dụng trong mỗi phòng thử nghiệm tham gia.

8.3.3. Chuyển đổi phương pháp

Nếu phòng thử nghiệm muốn sử dụng bộ marker đã được phòng thử nghiệm khác đánh giá, thì phải đăng ký trong quy trình đánh giá nội bộ phòng thử nghiệm (xem 8.2).

8.3.4. Thay đổi nền mẫu

Mọi thay đổi nền mẫu tiềm năng chỉ phải đánh giá nội phòng thử nghiệm.

CHÚ THÍCH: Thay đổi nền mẫu nghĩa là thay đổi một phần bất kỳ của tế bào ở giai đoạn bất kỳ.

...

...

...

9.1. Yêu cầu chung

Nên sử dụng các phép thử kiểm chứng là để hỗ trợ cho việc phát hiện các sai số đọc hoặc sai số thực nghiệm.

9.2. Hệ thống chú thích dữ liệu

Khi làm việc với các marker có kích thước cơ bản như SSR, thì nên dùng thang ADN thích hợp (chuẩn khối lượng phân tử) để thuận tiện cho việc chú thích dữ liệu. Không sử dụng thang ADN để thay thế phép thử kiểm chứng (xem 3.5.2).

Cần quan sát kiểm tra nếu dữ liệu được đọc bằng hệ thống tự động.

Việc chú thích tốt nhất là theo định dạng locus alen.

Các alen có thể được chú thích sử dụng mã số thông dụng đối với SSR, ví dụ: A, B, C, D v.v...trong đó A là alen nhỏ nhất v.v...

Đối với các marker có kích thước cơ bản, như SSR, thì các kết quả được báo cáo phải bao gồm kích thước dự kiến của mỗi marker.

Khi làm việc với các SNP, thì các kết quả cần được biểu thị theo ba định dạng như sau:

...

...

...

- đồng hợp tử 2 (huỳnh quang 2 hoặc băng 2), viết là B;

- đồng hợp tử 1 và 2 (huỳnh quang 1 và 2 hoặc băng 1 và 2), viết là AB.

Phòng thử nghiệm trả các kết quả theo kiểu huỳnh quang hoặc dải huỳnh quang.

9.3. Phân tích kết quả

Các kết quả có thể biểu thị theo Bảng 2.

Bảng 2 - Ví dụ về biểu thị kết quả

Marker 1

Marker 2

...

...

...

SSR

Kích thước dự kiến

Kích thước dự kiến

Kích thước dự kiến

SNP

A, B, AB

A, B, AB

A, B, AB

Mẫu 1

...

...

...

-

-

Chất chuẩn 1

-

-

-

Mẫu 2

-

-

...

...

...

Chất chuẩn 2

-

-

-

9.4. Biểu thị kết quả

9.5. Kiểm tra việc nhận biết

9.6. Sự tương hợp giữa mẫu cần phân tích và mẫu đối chứng

Nếu bộ dữ liệu xác định được đối với mẫu trùng khớp chính xác hình dạng quan sát được sử dụng cùng bộ marker trong mẫu đối chứng, thì báo cáo phải nêu rõ:

“Mẫu X giống hệt mẫu chuẩn Y liên quan đến hình dạng phân tử xác định được sử dụng các marker ADN Z; trong đó X là ký hiệu nhận dạng mẫu, Y là ký hiệu nhận dạng mẫu đối chứng và Z là tổng số marker được sử dụng”.

...

...

...

Nếu dữ liệu marker xác định được đối với mẫu khác với một hoặc nhiều marker từ hình dạng quan sát được sử dụng cùng bộ marker trong mẫu đối chứng, thì báo cáo phải nêu rõ:

“Mẫu X khác với mẫu chuẩn Y tại n marker ngoài các marker ADN được xác định”; trong đó X là ký hiệu nhận dạng mẫu, Y là ký hiệu nhận dạng mẫu đối chứng và n là số lượng marker mà ở đó mẫu X khác với mẫu đối chứng Y và Z là tổng số marker được sử dụng”.

9.4.2. Hình dạng phân tử của các giống

Các kết quả có thể được biểu thị theo Bảng 2 (xem 9.3).

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ và mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu biết);

c) ngày nhận mẫu;

...

...

...

e) ngày báo cáo kết quả;

f) phương pháp sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

g) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, có thể ảnh hưởng đến kết quả;

h) kết quả thu được (xem 9.4);

i) nếu kiểm tra lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 4995 (ISO 5527), Ngũ cốc - Thuật ngữ và định nghĩa

[2] TCVN 9990:2013 (ISO 7563:1998), Rau quả tươi- Thuật ngữ và định nghĩa

...

...

...

[4] TCVN 7608 (ISO 24276), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Yêu cầu chung và định nghĩa

[5] ISO 25720:2009, Health informatics - Genomic Sequence Variation Markup Language (GSVML)

[6] TCVN 8890 (ISO Guide 30), Terms and definitions used in connection with reference materials

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10990:2015 (ISO 13495:2013) về Thực phẩm - Nguyên tắc lựa chọn và tiêu chí đánh giá xác nhận các phương pháp nhận biết giống sử dụng axit nucleic đặc thù