Bảng 1 - Chương trình gradient đối với HPLC

Thời gian

min

Dung môi A

%

Dung môi B

%

Tốc độ dòng

ml/min

...

...

...

95

5

1,0

5,0

80

20

1,0

8,5

60

...

...

...

1,0

15,0

0

100

1,0

17,5

0

100

1,0

...

...

...

95

5

1,0

21,0

95

5

1,0

22,0

95

...

...

...

2,0

27,0

95

5

2,0

29,0

95

5

1,0

...

...

...

Sử dụng các thể tích bơm 20  để tính toán theo đường hồi qui tuyến tính và để xác định mẫu thử. Dựng đường chuẩn đối với diện tích pic theo nồng độ.

CHÚ THÍCH: Detector tán xạ ánh sáng không tuyến tính trên toàn dải đo (đường hiệu chuẩn hình S). Nồng độ của các dung dịch chuẩn đối chứng được chọn cần nằm trong dải tuyến tính.

Để định lượng các phospholipid nên sử dụng trình tự phân tích sau: R₁, R₂, R₃ (mỗi dung dịch bơm một lần), S_1a, S_1b (mỗi dung dịch bơm hai lần), R₁, R₂, R₃ (mỗi dung dịch bơm một lần).

9.4. Xác định

Bơm 20  dung dịch mẫu thử vào HPLC và ghi lại các diện tích pic. Nhận biết các pic bằng cách so sánh thời gian lưu của chất trong sắc ký đồ của các dung dịch chuẩn đối chứng và các phần mẫu thử (xem Hình A.1).

10. Tính và biểu thị kết quả

Sử dụng đường chuẩn để tính hàm lượng từng phopholipit (xem 9.3). Ba điểm hiệu chuẩn cho nồng độ thấp hơn và ba điểm hiệu chuẩn cho nồng độ cao hơn được so sánh với mẫu. Dung dịch R₁, R₂, R₃ (9.1.1) được pha loãng phụ thuộc vào mẫu để thu được sáu điểm hiệu chuẩn.

Phần khối lượng, W_i, tính bằng gam trên 100 g mẫu thử, của từng phospholipid đưa ra theo Công thức:

W_i =  x 100

...

...

...

m_pi là khối lượng của từng phospholipid xác định được từ đường chuẩn, tính bằng miligam (mg);

m là khối lượng mẫu thử (9.1.2), tính bằng miligam (mg).

Biểu thị kết quả đến một chữ số thập phân.

11. Độ chụm

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và các nền mẫu đã nêu.

11.2. Độ lặp lại

Giới hạn lặp lại, r, là giá trị nhỏ hơn hoặc bằng chênh lệch tuyệt đối giữa hai giá trị cuối cùng, mỗi giá trị thể hiện một dãy các kết quả thử, thu được trong điều kiện lặp lại được biểu thị với xác suất 95 %.

Các điều kiện lặp lại cho các kết quả thử thu được trên cùng một phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị và thuốc thử, trong một khoảng thời gian ngắn.

...

...

...

Giới hạn tái lập, R, là giá trị nhỏ hơn hoặc bằng chênh lệch tuyệt đối giữa hai giá trị cuối cùng, mỗi giá trị thể hiện dãy các kết quả thử, thu được trong điều kiện tái lập được biểu thị với xác suất là 95 %.

Các điều kiện tái lập xác định theo các điều kiện thử cho các kết quả thử thu được trên cùng một phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị và thuốc thử khác nhau, trong một khoảng thời gian ngắn.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được, nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

...

...

...

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

SẮC KÝ ĐỒ HPLC

CHÚ DẪN

1 N- acyl-phosphatidylethanolamin

2 axit phosphatidic

3 phosphatydylethanolamin

4 phosphatidylcholin

...

...

...

6 lysophosphatidycholin

t thời gian

V độ nhạy

Hình A.1 - Sắc ký đồ HPLC đối với phospholipid của lecithin đậu nành tự nhiên dạng thô

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

KẾT QUẢ PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

Độ chụm của phương pháp là kết quả của nghiên cứu liên phòng thử nghiệm được tổ chức bởi Hiệp hội Lecithin và phospholipid Quốc tế (ILPS) theo chuẩn Quốc tế. Nghiên cứu được tiến hành năm 1996 trên ba mẫu. Các kết quả thu được dựa trên phép phân tích theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1)^[3] và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2)^[4] cho dữ liệu về độ chụm theo Bảng B.1 đến B.6.

...

...

...

Thông số

Mẫu

A: lecithin
đậu nành thô

B: lecithin
đậu nành thô

Số phòng thử nghiệm tham gia, N

10

11

Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ, n

8

...

...

...

Số lượng các kết quả thử riêng rẽ của tất cả các phòng thử nghiệm trên từng mẫu, z

4

4

Giá trị trung bình, , % khối lượng

1,52

1,59

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r

0,04

0,05

...

...

...

2,3

3,2

Giới hạn lặp lại, r (= S_r x 2,8)

0,10

0,14

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R

0,11

0,20

Hệ số biến thiên tái lập, C_{V, R} %

...

...

...

12,6

Giới hạn tái lập, R (= S_R x 2,8)

0,30

0,55

Bảng B.2 - Kết quả phân tích thống kê của axit phosphatidic (PA)

Thông số

Mẫu

A: lecithin
đậu nành thô

B: lecithin
đậu nành thô

...

...

...

12

12

Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ, n

11

10

Số lượng các kết quả thử riêng rẽ của tất cả các phòng thử nghiệm trên từng mẫu, z

4

4

Giá trị trung bình, , % phần khối lượng

...

...

...

6,23

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r

0,17

0,20

Hệ số biến thiên lặp lại, C_{V, r} %

3,6

3,4

Giới hạn lặp lại, r (= S_r x 2,8)

0,46

...

...

...

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R

0,24

1,17

Hệ số biến thiên tái lập, C_{V, R} %

4,6

18,8

Giới hạn tái lập, R (= S_R x 2,8)

0,67

3,28

...

...

...

Thông số

Mẫu

A: lecithin
đậu nành thô

B: lecithin
đậu nành thô

Số phòng thử nghiệm tham gia, N

12

12

Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ, n

9

...

...

...

Số lượng các kết quả thử riêng rẽ của tất cả các phòng thử nghiệm trên từng mẫu, z

4

4

Giá trị trung bình, , % khối lượng

11,74

12,14

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r

0,17

0,21

...

...

...

1,5

1,7

Giới hạn lặp lại, r (= S_r x 2,8)

0,47

0,59

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R

0,34

0,37

Hệ số biến thiên tái lập, C_{V, R} %

...

...

...

3,0

Giới hạn tái lập, R (= S_R x 2,8)

0,94

1,03

Bảng B.4 - Kết quả thống kê của phosphatidylcholin (PC)

Thông số

Mẫu

A: lecithin
đậu nành thô

B: lecithin
đậu nành thô

...

...

...

Số phòng thử nghiệm tham gia, N

12

12

13

Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ, n

11

11

11

Số lượng các kết quả thử riêng rẽ của tất cả các phòng thử nghiệm trên từng mẫu, z

...

...

...

4

4

Giá trị trung bình, , % khối lượng

14,70

13,45

94,70

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r

0,25

0,27

...

...

...

Hệ số biến thiên lặp lại, C_{V, r} %

1,7

2,0

1,1

Giới hạn lặp lại, r (= S_r x 2,8)

0,69

0,76

2,28

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R

...

...

...

0,46

2,14

Hệ số biến thiên tái lập, C_{V, R} %

3,1

3,4

2,3

Giới hạn tái lập, R (= S_R x 2,8)

1,28

1,28

...

...

...

Bảng B.5 - Kết quả thống kê của phosphatidylinositol (PI)

Thông số

Mẫu

A: lecithin
đậu nành thô

B: lecithin
đậu nành thô

Số phòng thử nghiệm tham gia, N

12

12

Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ, n

...

...

...

11

Số lượng các kết quả thử riêng rẽ của tất cả các phòng thử nghiệm trên từng mẫu, z

4

4

Giá trị trung bình, , % khối lượng

9,36

9,87

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r

0,17

...

...

...

Hệ số biến thiên lặp lại, C_{V, r} %

1,8

2,0

Giới hạn lặp lại, r (= S_r x 2,8)

0,48

0,56

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R

0,30

0,33

...

...

...

3,2

3,4

Giới hạn tái lập, R (= S_R x 2,8)

0,83

0,93

Bảng B.6 - Kết quả thống kê của lysophosphatidylcholin (LPC)

Thông số

Mẫu

A: lecithin
đậu nành thô

...

...

...

Số phòng thử nghiệm tham gia, N

11

12

Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ, n

10

7

Số lượng các kết quả thử riêng rẽ của tất cả các phòng thử nghiệm trên từng mẫu, z

4

4

...

...

...

0,71

0,46

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r

0,06

0,03

Hệ số biến thiên lặp lại, C_{V, r} %

8,5

7,0

Giới hạn lặp lại, r (= S_r x 2,8)

...

...

...

0,09

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R

0,15

0,11

Hệ số biến thiên tái lập, C_{V, R} %

20,9

23,9

Giới hạn tái lập, R (= S_R x 2,8)

0,41

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 7153 (ISO 1042) Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức

[2] TCVN 2625 (ISO 5555) Dầu mỡ động vật và thực vật - Lấy mẫu

[3] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung

[4] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

1)  ILPS-LE01 là tên thương mại của sản phẩm do Tổ chức quốc tế lecithin và phospholipid cung cấp. Thông tin đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.

2) LiChrospher là tên thương mại của sản phẩm đươc cung cấp bởi Merch. Thông tin đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.

3) Ví dụ về sản phẩm được cung cấp từ Hiệp hội lecithin và phospholipid quốc tế. Thông tin đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm nếu cho kết quả tương tự.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10112:2013 (ISO 11701:2009) về Dầu mỡ động vật và thực vật – Xác định hàm lượng phospholipid trong lecithin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector tán xạ ánh sáng