Cài đặt tốc độ dòng của hệ thống bơm gradient rửa giải của thiết bị HPLC ở 1,0 ml/min.

Cài đặt nhiệt độ của bộ gia nhiệt cho cột ở 45⁰C. Xác định thời gian cân bằng cách kiểm tra độ phân giải của cột.

Độ đáp ứng của detector tại cuối mỗi lần chạy sắc ký (đường nền) cần bằng giá trị ban đầu. Rửa đẳng dòng 15 min thường là đủ.

Bơm: sử dụng bộ bơm bằng tay hoặc tự động để bơm 50 ml dung dịch (7.2.3) vào cột.

Các tín hiệu huỳnh quang HPLC từ dung dịch chuẩn làm việc (7.1.2) và mẫu phomat cứng (7.2.3) được nêu trong Hình 1 và Hình 2.

CHÚ DẪN:

t là thời gian

V là độ đáp ứng của pic

...

...

...

Hình 1 – Tín hiệu huỳnh quang HPLC từ dung dịch chuẩn làm việc (7.1.2)

CHÚ DẪN:

t là thời gian

V là độ đáp ứng của pic

1 là lysozym

Hình 2 – Tín hiệu huỳnh quang HPLC từ mẫu phomat cứng

8. Tính và biểu thị kết quả

8.1. Hiệu chuẩn một điểm

...

...

...

w_L =

Trong đó:

r_s là nồng độ của dung dịch chuẩn làm việc (7.1.2), tính bằng miligam trên lit (mg/l);

h_t là chiều cao pic hoặc diện tích pic của dung dịch thử (7.2);

h_­s là chiều cao pic hoặc diện tích pic của dung dịch chuẩn làm việc (7.1.2);

m_t là khối lượng phần mẫu thử (7.2), tính bằng gam (g);

V_t là thể tích phần mẫu thử (7.2), tính bằng mililit (ml).

Định kỳ kiểm tra độ tuyến tính của thiết bị và mẫu trắng thuốc thử.

8.2. Biểu thị kết quả

...

...

...

9. Độ chụm

Tiêu chuẩn này chưa được thử nghiệm và đánh giá liên phòng thử nghiệm, do đó chưa có giá trị độ chụm cũng như giới hạn phát hiện.

Dựa vào kinh nghiệm, giới hạn thấp nhất về định lượng hàm lượng lysozym là 5 mg/kg (xem 8.2).

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với mọi chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

...

...

...

Phụ lục A

(Tham khảo)

Đánh giá xác nhận bằng LC/MS

A.1. Yêu cầu chung

Đối với các pic lysozym trong các dung dịch thử, kết quả tìm được có thể đánh giá xác nhận bằng LC/MS. Các thông số MS về lysozym cần được tối ưu và cần điều chỉnh cho phù hợp với hệ thống thiết bị thủ công (ví dụ: điện áp của kim 3,0 kV, đầu dò 550⁰C, điện áp cone 130 V).

Sử dụng thiết bị LC/MS có khả năng vận hành trong các điều kiện sắc ký nêu trong A.3, khác với điều kiện đối với HPLC (7.3) vì không sử dụng axit trifluoaxetic và đo các tín hiệu khối m/z = 1431 [M+H₁₀]¹⁰⁺; 1590 [M+H₉­]⁹⁺ và 1788 [M+H₈]⁸⁺, thời gian lưu khoảng 12,5 min.

Kiểm tra xác nhận sự có mặt của lysozym qua việc phân bố đồng đều các mảnh phổ này trên toàn bộ pic lysozym giả định.

A.2. Thiết bị LC/MS

...

...

...

A.2.2. Bộ bơm thủ công hoặc tự động, có thể bơm các lượng 5 ml.

A.2.3. Bộ phận gia nhiệt cột, có thể duy trì ở 40⁰C ± 2⁰C.

A.2.4. Cột pha đảo, kích thước 250 mm x 4,6 mm, cỡ hạt 5 mm, được ổn định vài giờ không có axit trifluoaxetic.

A.2.5. Detector khối phổ, có thể vận hành ở chế độ ion ESI + tại m/z 1431; 1590 và 1788.

A.3. Điều kiện sắc ký

Sử dụng các dung môi rửa giải sau đây đối với LC/MS:

1) dung môi rửa giải A chứa 5 ml axit formic (loại phân tích) trong 1 lít nước (4.1.6).

2) dung môi rửa giải B chứa 5 ml axit formic trong 1 lít axetonitrile (4.1.5).

Cài đặt tốc độ dòng của hệ thống bơm gradient rửa giải của thiết bị HPLC ở 0,80 ml/min. Việc chia dòng cần là: 0,5 ml/min MS; 0,3 ml/min thải (khi 25% B); van chuyển đổi 0,0 min vào MS; 0,5 min ra thải; 7,0 min vào MS.

...

...

...

Gradient rửa giải khuyến cáo nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1 – Gradient rửa giải khuyến cáo

Thời gian

Dung môi rửa giải A^a

Dung môi rửa giải B^a

(min)

%

%

0,0

...

...

...

30

9,0

30

70

9,1

0

100

12,0

0

...

...

...

12,1

70

30

16,0

70

30

^a Gradient rửa giải có thể cần được điều chỉnh để có được độ phân giải như trong Hình 1.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Bình định mức

[3] PELLEGRINO, L., TIRELLI, A. Phương pháp HPLC phát hiện lysozym lòng trắng trứng gà trong sữa và sản phẩm sữa. Int. Diary J.2000, 10, pp. 435-442

[4] BÄRTSCHI, F., MURALT, L., RIEDER, KAMPFER, U., SCHALLER, J. Bestimmung von Lysozym in Käse mittels LC-MS [ Xác định lysozym trong phomát bằng LC-MS]. Mitl. Lebensm. Hyg, 2006, 97, pp. 478-488.

1) Sigma L-7651 là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng các sản phẩm này.

2) Schleicher & Schuell 595½ là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng các sản phẩm này.

3) Millex-GV PVDF 0,22 mm là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng các sản phẩm này.

4) PLRP-S 300 Ǻ là tên của sản phẩm được cung cấp bởi Polymer Laboratories, Ltd. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng các sản phẩm này.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10023:2013 (ISO 27105:2009) về Sữa và sản phẩm sữa – Xác định lysozym lòng trắng trứng gà bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao