8.5. Khẳng định

8.5.1. Thạch dinh dưỡng

Cấy chuyển tất cả, hoặc nếu không thực hiện được thì cấy càng nhiều càng tốt (xem ISO 8199) các khuẩn lạc cần phải khẳng định từ màng lọc và ủ khoảng (22 ± 2) h ở (36 ± 2) ^oC. Kiểm tra các đĩa cấy chuyển về độ tinh khiết và thử phản ứng oxidaza những khuẩn lạc có mầu nâu đỏ ban đầu (8.5.2).

8.5.2. Phép thử oxidaza

Nhỏ 2 đến 3 giọt thuốc thử oxidaza vừa chuẩn bị (5.2.4) lên giấy lọc trong đĩa Petri.

Dùng vòng cấy platin (không có Ni crom), vòng nhựa, que hoặc que thủy tinh, bôi dàn một số khuẩn lạc phát triển trên giấy lọc đã chuẩn bị. Quan sát nếu xuất hiện của màu xanh tím than trong khoảng 10 s là phản ứng dương tính. Hoặc, sử dụng bộ thử oxidaza bán sẵn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

8.5.3. Môi trường King’s B.

Cấy chuyển khuẩn lạc mầu nâu đỏ dương tính với oxidaza được nuôi cấy từ 8.5.1 lên môi trường King B và ủ tới 5 ngày ở (36 ± 2) ^oC1). Kiểm tra sự phát triển dưới bức xạ UV hàng ngày và ghi nhận sự xuất hiện của khuẩn lạc huỳnh quang. Ghi lại những khuẩn lạc huỳnh quang xuất hiện cho tới 5 ngày là dương tính.

8.5.4. Acetamide broth

...

...

...

8.5.5. Đếm

Đếm tất cả các khuẩn lạc được khẳng định Pseudomonas aeruginosa là những khuẩn lạc sinh pyocynanin (sắc tố xanh lam/xanh lục) hoặc những khuẩn lạc dương tính với oxidaza, phát xạ huỳnh quang dưới bức xạ UV (8.4 hoặc 8.5.3) và có thể tạo amoniac từ acetamid (8.5.4).

CHÚ THÍCH: Các khuẩn lạc phát huỳnh quang trên màng đầu tiên luôn luôn có phản ứng dương tính oxidaza, do vậy không cần thử đối với thông số này (xem Bảng 1).

9. Biểu thị kết quả

Từ số khuẩn lạc đặc trưng đếm được trên màng, và có tính đến tỷ lệ phép thử khẳng định tiến hành, tính số Pseudomonas aeruginosa được khẳng định có trong thể tích nước xác định. Đối với nước khoáng, nước suối và các loại nước đóng chai khác, thể tích là 250 ml (ví dụ xem Tài liệu tham khảo [1], [2] và [3]. Đối với các loại nước khác, thể tích thường là 100 ml.

VÍ DỤ

Nếu

- p là số khuẩn lạc xanh lam/xanh lục; tất cả đã được đếm là khuẩn lạc được khẳng định.

- F là số khuẩn lạc phát huỳnh quang;

...

...

...

- n_F là số khuẩn lạc phát huỳnh quang được thử về sinh ra amoniac;

- c_F là số khuẩn lạc phát huỳnh quang có sinh ra amoniac;

- n_R là số khuẩn lạc nâu đỏ được thử về sự tạo ra amoniac và oxidaza và phản ứng huỳnh quang trên môi trường King’s B;

- c_R là số khuẩn lạc nâu đỏ có sinh ra amoniac và oxidaza và phát xạ huỳnh quang trên môi trường King’s B

Như vậy, số Pseudomonas aeruginosa bằng P + F(c_F/n_F) + R(c_R/n_R) trên thể tích mẫu được kiểm tra.

Hoặc, biểu thị các kết quả định tính bằng cách ghi là Pseudomonas aeruginosa có hoặc không có trong thể tích nước được kiểm tra.

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải qui định như sau:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này TCVN 8881 (ISO 16266);

...

...

...

c) Kết quả được biểu thị theo Điều 9;

d) Mọi diễn biến đặc biệt quan sát được trong suốt quá trình phân tích và những thao tác không được qui định trong phương pháp hoặc được xem như tùy chọn mà có thể có ảnh hưởng đến kết quả.

11. Dữ liệu thực hiện phép thử

Phép thử với sáu phòng thí nghiệm từ năm quốc gia tham gia, các kết quả thu được như sau (xem Bảng 2).

Bảng 2 – Thử trên thạch Pseudomonas – Độ thu hồi trung bình (%) tương ứng với số đếm trên thạch dinh dưỡng sau pha loãng bằng nước cất và lọc

Chủng

Ủ

%

1

...

...

...

48 h

101,7

100,1

2

24 h

48 h

92,6

91,3

3

...

...

...

48 h

104,4

124,8

4

24 h

48 h

94,7

91,3

12. Cản trở

...

...

...

13. Đảm  bảo chất lượng

Có thể sử dụng Pseudomonas aeruginosa NCTC 10332 là đối chứng dương và E.coli NCTC 9001 là đối chứng âm cho tất cả các giai đoạn.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

THÔNG TIN BỔ SUNG VỀ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Pseudomonas aeruginosa là loài điển hình thuộc chi Pseudomonas.

Đây là vi khuẩn Gram âm, không tạo bào tử hình que, phản ứng sinh ra oxidaza và catalas. Vi khuẩn ức chế sự trao đổi chất oxi hóa như đã chỉ thị bằng phép thử Leifson và Hugh, thường khử nitrat sau giai đoạn nitrit và tạo ra amoniac từ sự phá hủy vỡ cấu trúc của acetamid. Hầu hết các chủng (98%) tạo ra sắc tố huỳnh quang tan trong nước. Đa số chủng Pseudomonas aeruginosa này có khả năng phát triển tố huỳnh quang tan trong nước. Đa số các chủng Pseudomonas aeruginosa này có khả năng phát triển ở 42 ^oC nhưng không phát triển được ở 4 ^oC còn Pseudomonas fluorescen thì phát triển ở 4^oC nhưng không phát triển ở 42 ^oC.

Pseudomonas aeruginosa hóa lỏng gelatin, thủy phân casein, nhưng không thủy phân tinh bột. Hơn 90% các chủng tạo ra sắc tố pyocyanin (xanh lam – xanh lục).

...

...

...

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

MÔI TRƯỜNG THAY THẾ

Có thể sử dụng môi trường thay thế cho thạch dinh dưỡng, miễn là môi trường đó không chọn lọc và không chứa hydrat cacbon lên men.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Council Directive 80/777/EEC on the approximation of the laws of the Member States relating to the exploitation and marketing of natural mineral waters. Official Journal of the European Communities L229, 1980, pp. 1 -10.

[2] Dirextive 96/70/EC of the European Parliament and of the Council amending Council Directive 80/777/EEC on the approximation of the laws of the Member Stale relating to the exploitation and marketing of nature mineral waters. Official Journal of the European Communities L229, 1996, pp. 26-28.

[3] Council Directive 98/83/EC on the quality of water intended for human consumption. Official Journal of the European Communities L330, 1998, pp. 32-53.

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8881:2011 (ISO 16266:2006) về Chất lượng nước - Phát hiện và đếm pseudomonas aeruginosa - Phương pháp màng lọc