5.2.2. Hòa 20 mL etanol 95 % vào 1 L nước cất loại II. Đun sôi trong bể điều nhiệt để tránh sự phân hủy của cacbonhydrat, chuyển ngay lập tức ra khỏi bể điều nhiệt và làm nguội xuống dưới 45^oC. Không khử trùng bằng nồi hấp, pH cuối cùng phải nằm trong khoảng từ 7,1 đến 7,3.

5.2.3. Bảo quản môi trường hoàn tất trong tối ở 2⁰C đến 10⁰C và đổ bỏ môi trường chưa dùng sau 96 h. Môi trường mẫn cảm với ánh sáng.

CHÚ THÍCH: Môi trường này có thể làm đông kết bằng cách thêm 1,2 % đến 1,5 % thạch trước khi đun sôi.

5.3. Môi trường trytose lauryl: xem Method 9131 Total coliform - Muiltiple tube fermentation technique (Xác định Coliform tổng số - Kỹ thuật lên men nhiều ống), 5.3.

6. Lấy, bảo quản và xử lý mẫu

6.1. Tất cả các mẫu phải được lấy theo kế hoạch lấy mẫu được quy định trong các tiêu chuẩn về lấy mẫu vi sinh.

6.2. Làm sạch hoàn toàn tất cả các dụng cụ thủy tinh bằng chất tẩy rửa thích hợp và nước nóng, súc rửa bằng nước nóng để loại bỏ tất cả chất tẩy rửa còn dư lại, và cuối cùng, súc rửa bằng nước cất (loại II). Nếu sử dụng máy rửa, thì máy phải có hệ thống ống dẫn nước làm bằng thép không gỉ hoặc vật liệu không độc hại với vi khuẩn. Không sử dụng ống bằng đồng để dẫn nước cất loại II. Sử dụng hệ thống xả nước bằng thép không gỉ hoặc vật liệu không độc hại.

6.2.1. Khử khuẩn dụng cụ thủy tinh, ngoại trừ khi chứa trong hộp bằng kim loại, trong khoảng 60 min ở nhiệt độ 170 ^oC, nếu nhiệt độ toàn bộ là đồng nhất thì khử khuẩn ở 160 ^oC. Sấy dụng cụ thủy tinh trong hộp kim loại ở 170 ^oC trong thời gian không ít hơn 2 h.

6.2.2. Khử trùng chai chứa mẫu trừ các chai làm bằng nhựa, như trên, hoặc trong nồi hấp ở 121 ^oC trong 15 min.

...

...

...

6.2.4. Nếu lấy mẫu nước có nồng độ đồng hoặc kẽm cao và mẫu nước thải có nồng độ các kim loại nặng cao vào chai có chứa sẵn chất tạo chelat thì sẽ làm giảm độ độc của kim loại. Việc này đặc biệt có ý nghĩa khi thời gian vận chuyển mẫu nhiều hơn 4 h. Sử dụng muối tetranatri của axit etylendiamintetraaxetic (EDTA) có nồng độ 372 mg/L. Điều chỉnh pH dung dịch EDTA về 6,5 trước khi dùng. Có thể thêm riêng biệt EDTA hoặc kết hợp EDTA với dung dịch Na₂S₂O₃ vào chai trước khi khử khuẩn (0,3 mL dung dịch 10 % EDTA cho chai dung tích 120 mL).

6.3. Khi nạp mẫu vào chai, để một khoảng không khí trong chai (ít nhất là cao 2,5 cm) để thuận tiện cho việc lắc trộn mẫu trước phân tích. Chú ý khi lấy mẫu phải đại diện cho nước được thử nghiệm và tránh làm nhiễm bẩn mẫu tại thời điểm lấy mẫu hoặc trong thời gian trước phân tích (thử nghiệm).

6.4. Chai đựng mẫu phải được nút kín cho đến khi nạp mẫu. Mở nút chai cẩn thận để tránh đất và chất bẩn bắn vào chai. Trong khi lấy mẫu, không cầm nắp hoặc cổ chai, và bảo quản chúng sao cho không bị nhiễm bẩn. Giữ chai ở gần phần đáy chai, nạp mẫu vào chai đủ lượng cần thiết mà không được làm tràn ra, nắp nút chai ngay lập tức và đảm bảo phải chặt và chắc.

6.5. Cần tiến hành phân tích vi khuẩn của mẫu nước ngay sau khi lấy để tránh những thay đổi không dự đoán được. Nếu không thể phân tích mẫu trong vòng 1 h kể từ khi lấy mẫu, phải bảo quản lạnh khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm.

6.6. Duy trì nhiệt độ của tất cả các mẫu ô nhiễm dưới 10 ^oC trong thời gian vận chuyển tối đa là 6 h. Giữ lạnh những mẫu này ngay khi đưa đến vào phòng thí nghiệm và phân tích trong vòng 2 h. Nếu thời gian vận chuyển cần nhiều hơn 6 h, nên phân tích ngay tại hiện trường bằng các thiết bị phân tích vi sinh (coliform) hiện trường hoặc sử dụng quá trình nuôi cấy kéo dài thời gian (tủ ấm ủ chậm)

7. Qui trình (xem Hình 1)

7.1. Lựa chọn lượng mẫu

7.1.1. Lượng mẫu lấy phân tích phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn dự kiến và mật độ vi khuẩn này trong mẫu chỉ bị ảnh hưởng bởi độ đục.

7.1.2. Lượng mẫu lý tưởng là lượng mẫu cho khoảng 50 khuẩn lạc coliform và không quá 200 khuẩn lạc của tất cả các vi khuẩn. Với các mẫu nước đã qua xử lý, tiến hành lọc hai lượng mẫu thử như nhau, ví dụ như 100 mL hoặc 500 mL hoặc lớn hơn, hoặc hai thể tích mẫu đã pha loãng. Với các loại mẫu nước khác tiến hành lọc ba (lọc 3 mẫu) lượng mẫu thử khác nhau tùy thuộc vào mật độ vi khuẩn dự kiến. Nếu thể tích cần lọc nhỏ hơn  20 mL (pha loãng hoặc không pha loãng), thêm một lượng nhỏ nước cất vô khuẩn vào phễu lọc trước khi lọc. Việc tăng thể tích nước này giúp cho huyền phù vi khuẩn phân tán đồng đều trên toàn bộ bề mặt màng lọc.

...

...

...

7.2.1. Dùng kẹp vô khuẩn, đặt màng lọc vô khuẩn trên giá đỡ màng lọc của bộ phận lọc, mặt có đường lưới hướng lên trên. Cẩn thận đặt phễu vào giá đỡ và cố định bằng khóa cài. Lọc mẫu trong điều kiện chân không yếu. Khi mẫu trong phễu vừa cạn hết, vẫn để nguyên màng lọc tại chỗ, tráng phễu ba lần bằng 20 mL đến 30 mL nước pha loãng vô khuẩn, Mở khóa và tháo phễu, dùng kẹp vô khuẩn chuyển màng lọc đặt lên tấm hấp thụ hoặc mặt thạch (tấm dinh dưỡng) theo cách trải thảm để tránh tạo bọt khí.

7.2.2. Sử dụng thiết bị lọc vô khuẩn mỗi khi bắt đầu một dãy lọc để giảm thiểu sự nhiễm bẩn ngẫu nhiên. Dãy lọc được coi là bị ngắt quãng khi thời gian dừng giữa các lần lọc mẫu lớn hơn 30 min. Sau những lần bị ngắt quãng như thế, cần xử lý mẫu như một dãy lọc mới và phải khử khuẩn tất cả các dụng cụ sử dụng.

7.2.3. Khử khuẩn dụng cụ giữa các dãy lọc bằng hơi nước, nước sôi, hoặc, nếu có thể, dùng máy khử khuẩn bằng tia cực tím. Khi sử dụng qui trình khử khuẩn bằng tia UV, thời gian 2 min phơi nhiễm với bức xạ UV là đủ để khử được 99,9 % vi khuẩn. Nên bảo vệ mắt để phòng tránh sự lọt bức xạ từ buồng khử khuẩn. Thiết bị UV này chưa phải là sản phẩm thương mại vì thế không yêu cầu bắt buộc phải sử dụng, nhưng không được khuyến nghị sử dụng.

7.3. Kỹ thuật làm giàu hai bước

7.3.1. Đặt tấm hấp thụ vô khuẩn lên nắp trên của đĩa nuôi cấy vô khuẩn và dùng pipet chuyển vào vừa đủ lượng môi trường làm giàu (từ 1,8 mL đến 2,0 mL môi trường lauryl trytose đến bão hòa). Cẩn thận loại bỏ lượng dung dịch thừa. Khử khuẩn nơi đặt màng lọc mà qua đó mẫu đã được chuyển vào tấm hấp thụ. Ủ màng lọc, mà không đảo đĩa trong thời gian 1,5 đến 2h ở (35 ± 0,5) ^oC, độ ẩm tương đối tối thiểu là 90 %.

7.3.2. Chuyển đĩa nuôi cấy làm giàu ra khỏi tủ ấm, nhấc màng lọc khỏi tấm hấp thụ và đặt nó lên trên bề mặt thạch. Nếu thấy có bọt khí dưới màng lọc, cẩn thận đặt lại màng lọc lên bề mặt thạch. Trong trường hợp sử dụng môi trường lỏng, chuẩn bị quá trình nuôi cấy tiếp theo bằng cách lấy đĩa nuôi cấy làm giàu ra khỏi tủ ấm và tách đĩa làm hai nửa. Đặt tấm hấp thụ vô khuẩn vào nửa đáy hộp lồng và bão hòa tấm hấp thụ từ 1,8 mL đến 2,0 mL môi trường M-Endo. Chuyển màng lọc có mẫu cẩn thận lên trên tấm hấp thụ mới. Loại bỏ miếng đệm đã dùng. Đảo đĩa chứa thạch hoặc môi trường lỏng và ủ trong khoảng 20 h đến 22 h ở (35 ± 0,5) ^oC.

CHÚ THÍCH: Hiện nay, trên thị trường có sẵn sản phẩm tấm dinh dưỡng (tấm hấp thụ đã có chất dinh dưỡng đựng trong hợp lồng vô khuẩn, khi sử dụng chỉ cần thêm nước cất theo lượng do nhà sản xuất quy định. Sử dụng các tấm dinh dưỡng có sẵn theo hướng dẫn của nhà sản xuất, nếu phù hợp.

7.4. Đếm

7.4.1. Khuẩn lạc coliform đặc trưng có màu hồng đến đỏ thẫm với bề mặt ánh kim. Vùng ánh kim có kích thước thay đổi từ chấm nhỏ đến phủ toàn bộ bề mặt khuẩn lạc. Quan sát và đếm các khuẩn lạc bằng kính hiển vi soi nổi trường rộng hai mắt độ phóng đại thấp (10 lần đến 15 lần) hoặc các thiết bị quang học tương tự với một nguồn ánh sáng huỳnh quang trắng như đã nêu ở trên và chiếu càng vuông góc với mặt phẳng màng lọc càng tốt. Tổng số khuẩn lạc đếm được (coliform và không phải coliform) trên môi trường M-Endo không có mối liên quan với tổng số vi khuẩn có trong mẫu gốc, và như đã biết không thể suy luận về mối tương quan với chất lượng của mẫu nước.

...

...

...

7.5.1. Báo cáo mật độ coliform tính theo số coliform (tổng số)/100 mL. Tính số vi khuẩn coliform trên màng lọc có 20 khuẩn lạc coliform đến 80 khuẩn lạc coliform và không quá 200 khuẩn lạc của tất cả các vi khuẩn theo công thức sau:

(Tổng số)                      =

Vi khuẩn coliform/100 mL

7.5.2. Nước có chất lượng nước uống

7.5.2.1. Đối với nước có chất lượng tốt, số lượng khuẩn lạc coliform sẽ nhỏ hơn 20 trên một màng lọc. Trong trường hợp này, đếm tất cả các khuẩn lạc coliform và sử dụng công thức nêu ở trên để tính mật độ coliform.

7.5.2.2. Nếu xảy ra hiện tượng phát triển chập nhau, khi đó các khuẩn lạc phát triển chồng lên nhau trên một phần hoặc toàn bộ màng lọc thì báo cáo kết quả là "phát triển chập nhau". Nếu tổng số lượng khuẩn lạc coliform và không phải coliform và không phải coliform lớn hơn 200 trên mỗi màng lọc, hoặc nếu số khuẩn lạc quá nhiều không thể đếm chính xác, thì báo cáo kết quả là "quá nhiều không đếm được". Trong cả hai trường hợp này đều phải yêu cầu lấy một mẫu mới và chọn thể tích thích hợp hơn để lọc, cần lưu ý rằng thể tích mẫu thử tiêu chuẩn cho nước uống là 100 mL. Vì thế, thay cho 100 mL lọc trên một màng lọc bằng cách lọc với hai màng lọc, mỗi màng lọc 50 mL, hoặc lọc với bốn màng lọc, mỗi màng lọc là 25 mL, v.v … Đếm coliform tổng số quan sát được trên các màng lọc và báo cáo theo số lượng trên 100 mL.

7.5.3. Nước có chất lượng khác chất lượng nước uống

7.5.3.1. Tương tự như với các mẫu nước có thể uống được, nếu không có màng lọc nào có số lượng coliform đếm được nằm trong khoảng lý tưởng, báo cáo số lượng coliform theo tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các màng lọc cho 100 mL mẫu. Ví dụ, nếu hai phần mẫu, mỗi phần 50 mL được lọc trên hai màng lọc và tương ứng có năm và ba khuẩn lạc coliform, báo cáo kết quả là tám khuẩn lạc coliform trên 100 mL nghĩa là:

...

...

...

7.5.3.3. Mặt khác, nếu các phần mẫu 10 mL, 1,0 mL và 0,1 mL được lọc và tương ứng có số khuẩn lạc coliform là 40,9 và 1, thì chỉ chọn phần mẫu 10 mL để tính mật độ coliform vì màng lọc này có số lượng khuẩn lạc coliform nằm trong khoảng lý tưởng. Kết quả là 400/100 mL, nghĩa là:

Trong ví dụ cuối cùng này, nếu màng lọc có 40 khuẩn lạc coliform và có tổng số khuẩn lạc vi khuẩn lớn hơn 200, thì cũng báo cáo kết quả số khuẩn lạc coliform là 400/100 mL.

7.5.3.4. Báo cáo có "phát triển chập nhau" hoặc màng lọc có quá nhiều khuẩn lạc không thể đếm được" như đã nêu trong 7.5.2. Yêu cầu mẫu mới và chọn thể tích thích hợp hơn để lọc.

7.5.4. Mức độ tin cậy theo thống kê của kết quả sử dụng kỹ thuật màng lọc

Mặc dù mức độ tin cậy của kỹ thuật màng lọc theo thống kê là lớn hơn mức độ tin cậy của kỹ thuật MPN, nhưng số đếm trên màng lọc không phải là con số đúng tuyệt đối. Bảng 1 minh họa một số mức tin cậy 95 %.

Bảng 1 - Mức tin cậy 95 % đối với kết quả màng lọc sử dụng lượng mẫu 100 mL

Số lượng khuẩn lạc coliform đếm được

...

...

...

Dưới

Trên

1

2

3

4

5

0,05

0,35

...

...

...

1,4

2,0

3,0

4,7

6,3

7,7

9,2

Hình 1 - Quy trình xác định coliform tổng số theo kỹ thuật màng lọc

...

...

...

8.1. Qui trình kiểm soát chất lượng chung đã được nêu trong Phần IV của U.S. EPA. 1978^[2]. Những qui trình này phải được thực hiện tại mọi thời điểm.

8.2. Mẫu phải được duy trì càng giống điều kiện ban đầu càng tốt bằng cách bảo quản và xử lý cẩn thận. Vị trí và tần suất lấy mẫu phải đại diện cho các đặc tính và tính thay đổi của chất lượng nước tại vị trí đó. Các mẫu phải được phân tích ngay lập tức. Nếu không thể phân tích ngay, thì mẫu phải được bảo quản lạnh ở nhiệt độ từ 1 ^oC đến 4 ^oC và phân tích trong vòng 6 h kể từ khi lấy mẫu.

8.3. Kiểm soát chất lượng của môi trường nuôi cấy có tính quyết định tới độ đúng của kết quả phân tích vi sinh. Một số yếu tố quan trọng cần chú ý được tổng hợp dưới đây.

8.3.1. Môi trường chỉ được dùng trong một năm: luôn luôn sử dụng dung dịch mua về trước. Duy trì bảng kê của tất cả các  môi trường đã mua, kể cả kết quả kiểm tra bằng quan sát.

8.3.2. Lưu giữ môi trường nguyên gói không quá hai năm. Các gói môi trường đã mở phải loại bỏ sau sáu tháng.

8.3.3. Khi chuẩn bị môi trường, làm sao để thời gian mở các gói chứa môi trường càng ngắn càng tốt. Chuẩn bị môi trường bằng nước đã loại ion hoặc nước cất (loại II) có chất lượng được chứng nhận. Kiểm tra pH của môi trường sau khi pha thành dung dịch và khử khuẩn; pH phải trong khoảng 0,2 đơn vị so với giá trị quy định. Nếu không đạt, phải loại bỏ và làm lại.

8.3.4. Thời gian tối thiểu khi khử khuẩn bằng nồi hấp do nhà sản xuất qui định, vì nguy cơ làm hư hỏng môi trường sẽ tăng cao khi tiếp xúc nhiều với nhiệt. Lấy môi trường đã khử khuẩn ra khỏi nồi hấp ngay khi áp suất về không. Hiệu quả của việc khử khuẩn phải được kiểm tra hằng tuần, sử dụng strip hoặc ampuls Bacillus stearothemophelus.

8.3.5. Phải để các đĩa thạch hơi mở trong khoảng 15 min sau khi rót hoặc chuyển ra khỏi tủ lạnh để làm bay hơi ấm. Các đĩa thạch phải có bề mặt bằng phẳng, không bị vón cục hoặc có bọt khí vì chúng có thể làm giảm sự tiếp xúc giữa thạch với môi trường.

8.3.6. Kiểm tra chất lượng của môi trường đã chuẩn bị bao gồm cả việc ủ là 5 % của mỗi mẻ môi trường trong hai ngày tại 35 ^oC để giám sát sự phát triển của khuẩn lạc và kiểm tra âm tính/dương tính với môi trường nuôi cấy nguyên chất.

...

...

...

8.4.1. Phân tích lặp ít nhất 10 % của tất cả mẫu dương tính đã biết.

8.4.2. Phân tích ít nhất một mẫu kiểm tra dương tính cho từng tháng với từng thông số thử nghiệm.

8.4.3. Phân tích ít nhất một mẫu kiểm tra âm tính cho từng loạt mẫu phân tích sử dụng nước đệm và mẻ môi trường đem sử dụng tại thời điểm bắt đầu của loạt phép thử và cứ sau mỗi mười mẫu. Khi mẫu kiểm tra cho thấy có nhiễm bẩn, thì phải tẩy và phân tích mẫu mới.

8.4.4. Sử dụng nước cất loại II để kiểm tra định kỳ về sự nhiễm bẩn.

8.5. Các qui định kiểm soát chất lượng đối với màng lọc

8.5.1. Có thể mua các bộ lọc màng vô khuẩn hoặc được đóng gói để khử khuẩn. Màng lọc này có thể được khử khuẩn bằng nồi hấp, dùng etylen oxit, hoặc chiếu xạ. Nhà sản xuất màng lọc phải chứng nhận các màng lọc của họ đáp ứng được các qui định về tính vô khuẩn, độ bám, độ thu hồi, cỡ lỗ, tốc độ dòng, pH, độ axit tổng, hàm lượng phosphat, và các quy định khác.

8.5.2. Tính năng của màng lọc phải được thử để đảm bảo các kết quả là phù hợp. Phải kiểm tra sự phù hợp của mỗi lô hàng về hình dạng, đường kẻ lưới, khả năng khuếch tán và sự phát triển đúng của khuẩn lạc. Cần phải xem xét những màng lọc không có khuẩn lạc phát triển trên vùng có diện tích lớn.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] Bordner, R. H., et al., Microbiological Methods for Monitoring the Environment, Environmental Monitoring and Support Laboratory, U.S. EPA, Cincinnati, OH, EPA-600/8-78-017, 1978.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8775:2011 (EPA METHOD 9132) về Chất lượng nước - Xác định coliform tổng số - Kỹ thuật màng lọc