Sục khí vào nước pha loãng cho đến khi nồng độ của oxy hòa tan đạt tới ít nhất 90 % giá trị bão hòa khi trong dung dịch (AVS) và pH ổn định ở 7,8 ± 0,2. Nếu cần, điều chỉnh pH của dung dịch bằng cách thêm dung dịch natri hydroxit hoặc axít clohydric. Vì thế nước pha loãng đã chuẩn bị không nhận thêm sục khí cưỡng bức trước khi sử dụng trong phép thử.

3.3. Dung dịch gốc của chất thử

Dung dịch gốc là một hỗn hợp xác định của chất thử phải được chuẩn bị bằng cách hòa tan một lượng chất thử đã biết vào một thể tích xác định của nước pha loãng, nước đã loại ion hoặc nước được cất bằng thiết bị thủy tinh. Để có thể chuẩn bị dung dịch gốc và hỗ trợ trong việc chuyển vào bình thử, chất ít tan trong nước có thể được hòa tan hoặc phân tán bằng biện pháp thích hợp, kể cả các thiết bị sóng siêu âm và dung môi hữu cơ có độc tính thấp đối với cá. Nếu dung môi hữu cơ nào đó được sử dụng thì nồng độ dung môi trong dung dịch thử không quá 0,1 ml/l, hoặc thể tích chứa 0,1 g/l, tùy mức nào lớn hơn. Nếu sử dụng dung môi, cần có hai bộ mẫu đối chứng, trong đó một bộ chứa dung môi ở nồng độ cao nhất được sử dụng cho mọi bình thử và một bộ không chứa dung môi hoặc chất thử.

3.4. Dung dịch thử

Dung dịch thử được chuẩn bị bằng cách thêm một lượng thích hợp dung dịch gốc của chất thử vào nước pha loãng để đạt được nồng độ yêu cầu. Khi chuẩn bị dung dịch gốc bằng nước cất hoặc nước khử ion thì không nên thêm quá 100 ml dung dịch gốc vào 10 l nước pha loãng.

4. Thiết bị, dụng cụ

Tất cả vật liệu có thể tiếp xúc với chất lỏng mà cá sẽ được thả vào, hoặc với vật mà cá có khả năng tiếp xúc phải là chất trơ hoặc không hấp thụ chất thử đáng kể.

Thiết bị phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị sau:

4.1. Bình thử, có dung tích thích hợp (có thể cần lớn hơn 10 I), với diện tích bề mặt giữa không khí và môi trường thử lớn (khoảng 800 cm² cho 10 l môi trường) và có nút đậy vừa khít và cố định an toàn. Dung tích của bình thử phải đủ lớn để tỷ lệ cá thả không quá 1 g cá trên 1 I nước trong thời gian thử.

...

...

...

4.2. Thiết bị kiểm soát nhiệt độ, để điều tiết nhiệt độ của dung dịch thử và nước trong bể dung dịch gốc ở 23 °C ± 1 °C bằng các phương pháp phù hợp.

4.3. Vợt, làm bằng nilon hoặc vật liệu trơ về hóa học khác dùng cho bình đối chứng và các vợt khác cho tất cả các bình thử (4.1).

5. Môi trường thử

Việc chuẩn bị và bảo quản dung dịch, nuôi cá, và tất cả các thao tác và phép thử được thực hiện trong phòng có không khí sạch, không chứa các chất ô nhiễm ở nồng độ có hại trong không khí.

Phải cẩn thận tránh sự xáo trộn không mong muốn vì có thể làm thay đổi hành vi của cá. Thực hiện tất cả các phép thử trong điều kiện ánh sáng phòng thử nghiệm thông thường với thời gian chiếu sáng hàng ngày từ 12 h đến 16 h.

6. Cách tiến hành

6.1. Điều kiện về cá

Bất kể khi nào có thay đổi về quần thể gốc, phải tiến hành phép thử độc tính sử dụng phương pháp đã định trong tiêu chuẩn này sử dụng hóa chất chuẩn thích hợp [ví dụ kali dicromat (K₂Cr₂O₇)). Kết quả của phép thử này phải thống nhất hợp lý với kết quả trong phép thử trước trong cùng một phòng thử nghiệm.

Không sử dụng cá thử đã sử dụng trong quá trình thử trước.

...

...

...

6.2. Phép thử giới hạn

Sử dụng quy trình mô tả trong tiêu chuẩn này, phép thử giới hạn có thể được tiến hành tại giới hạn của dịch thể lỏng hòa tan trong nước trong điều kiện của phép thử hoặc ở 100 mg/l, tùy theo mức nào thấp hơn, để cho thấy giá trị LC₅₀-96 h lớn hơn nồng độ này. Nếu không có cá chết trong phép thử giới hạn thì không yêu cầu phép thử tiếp theo.

Tiến hành phép thử giới hạn bằng cách sử dụng 10 con cá, và cùng số lượng trong (các) mẫu đối chứng.

CHÚ THÍCH 1: Lý thuyết nhị thức chỉ ra rằng, khi sử dụng 10 con cá, với tỷ lệ chết bằng “không” có độ tin cậy 99,9 % thì giá trị LC₅₀-96 h lớn hơn nồng độ thử giới hạn. Nếu có tỷ lệ chết, phải xem xét tiến hành một nghiên cứu hoàn chỉnh (xem 6.3 và 6.4). Cần ghi lại nếu quan sát thấy ảnh hưởng gần gây chết.

6.3. Phép thử sơ bộ

Thêm ít nhất 2,5 I, tốt nhất là 5 I, nước pha loãng tiêu chuẩn (3.2) vào từng bình trong số sáu bình thử (4.1) và sục khí nếu cần khôi phục nồng độ oxy hòa tan đến ít nhất 90 % giá trị bão hòa khí của dung dịch.

Chuẩn bị dung dịch thử bằng cách thêm lượng thích hợp dung dịch gốc của chất thử (3.3) vào năm bình để thu được dãy cấp số mũ về nồng độ, ví dụ 1000 mg/l; 100 mg/l; 10 mg/l; 1 mg/l và 0,1 mg/l. Không thêm gì vào bình thứ sáu là bình đối chứng, Dung dịch được điều chỉnh và duy trì ở 23 °C ±1 °C (4.2) không được sục khí trong quá trình thử này.

Cho ba con cá vào mỗi bình.

Ít nhất hai lần một ngày, ghi lại số cá chết và nồng độ oxy hòa tan trong mỗi bình. Loại bỏ cá chết.

...

...

...

6.4. Phép thử cuối cùng

Chọn ít nhất năm nồng độ tạo thành một dãy cấp số mũ, ví dụ 8 mg/l; 4 mg/l; 2 mg/I; 1 mg/l và 0,5 mg/l, nhưng phải bao gồm cả nồng độ thấp nhất làm chết toàn bộ cá trong phép thử sơ bộ và nồng độ không gây chết cao nhất trong vòng 96 h. Dãy nồng độ được chọn này phải cung cấp xác suất thu được tỷ lệ chết từ 0 % đến 100 % trong ít nhất hai nồng độ liên tiếp của dãy cấp số mũ được sử dụng, điều này cần để ước tính LC₅₀ bằng sử dụng phương pháp “tin cậy xác suất “probit”“.

Trong một số trường hợp, có thể yêu cầu khoảng nồng độ hẹp hơn để cung cấp các số liệu cần thiết và trong trường hợp khác lại cần khoảng nồng độ rộng hơn.

Lấy ít nhất sáu bình thử (4.1) và đổ vào mỗi bình, ví dụ, 10 l nước pha loãng tiêu chuẩn (3.2). Không thêm gì vào một trong số các bình này (đối chứng), nhưng với các bình khác thêm từng lượng khác nhau của dung dịch gốc (3.3) được yêu cầu để tạo nên một dãy nồng độ riêng của chất thử đã chọn. Nếu sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan một chất, phải chuẩn bị mẫu đối chứng thứ hai với nước pha loãng tiêu chuẩn có chứa một lượng vừa đủ dung môi hữu cơ để có được nồng độ dung môi cao nhất mà tại nồng độ này dung môi có trong mọi dung dịch thử. Khi dung dịch thử (3.4) được điều chỉnh về nhiệt độ 23 °C ± 1 °C (4.2), cho ít nhất bảy con cá vào mỗi bình như sau.

Chọn ngẫu nhiên cá trong đàn cá gốc vã ngay lập tức thả ngẫu nhiên vào các bình thử, sử dụng vợt có lỗ nhỏ, làm bằng vật liệu trơ mềm (4.3). Loại bỏ bất kỳ con cá nào bị rơi hoặc thao tác không đúng trong quá trình di chuyển. Trong phép thử này, cho tất cả cá vào bình trong khoảng thời gian 30 min.

Không được phép sục khí dung dịch. Ghi số cá chết trong mỗi bình ít nhất hàng ngày trong quá trình thử. Loại bỏ từng con cá chết khỏi bình càng nhanh càng tốt. Việc quan sát có thể diễn ra thường xuyên hơn, ví dụ để tính toán khoảng thời gian sống trung bình thu được cho mỗi nồng độ.

Ghi lại mọi hành vi bất thường của cá.

Nếu chất được nêu có tính bền trong thời gian tiếp xúc, nếu có thể, đo nồng độ chất thử trong bình thử ít nhất tại thời điểm bắt đầu và kết thúc phép thử.

Đo nồng độ oxy hòa tan, pH và nhiệt độ của dung dịch đang thử đi qua từ mỗi bình ít nhất một lần một ngày và tại thời điểm bắt đầu và kết thúc phép thử. Nhiệt độ và pH của dung dịch không thay đổi quá ± 1 °C hoặc 0,2 đơn vị pH.

...

...

...

7. Biểu thị kết quả

7.1. Tính hợp lệ

Kết quả được coi là hợp lệ nếu đáp ứng đầy đủ các yêu cầu sau:

a) Nồng độ oxy hòa tan của dung dịch thử trong quá trình thử phải đạt ít nhất 60 % ASV;

b) Nồng độ chất thử không được biết (hoặc nghi ngờ) bị thất thoát đáng kể trong quá trình thử (xem Điều 2);

c) Tỷ lệ chết của cá đối chứng không quá 10 % hoặc một con trong một bể;

d) Tỷ lệ cá đối chứng có hành vi bất thường không quá 10 % hoặc một con trong một bể;

e) Giá trị LC₅₀-24 h của hóa chất chuẩn [ví dụ kali dicromat (K₂Cr₂O₇)] nếu áp dụng, cho bể cá gốc phải thống nhất hợp lý với kết quả trong phép thử trước trong cùng một phòng thử nghiệm.

7.2. Ước tính giá trị LC₅₀

...

...

...

Sẽ thích hợp hơn nếu vẽ số liệu trên giấy vẽ đồ thị trên các trục với thang chia theo logarit và đơn vị xác suất. Số liệu được vẽ theo cách này sẽ tạo nên tương quan tuyến tính, từ đó có thể nội suy LC₅₀ như trên (xem Hình 2).

Nếu cần ước tính độ dốc, giới hạn tin cậy 95 % và LC₅₀, thì khuyến nghị các phân tích thống kê này thường có giá trị trong việc biểu thị kết quả, số liệu có thể được phân tích bằng đồ thị (xem tài liệu tham khảo [2] trong thư mục tài liệu tham khảo).

Nếu có sẵn thiết bị tính toán, có thể áp dụng phân tích probit (xem tài liệu tham khảo [1] trong thư mục tài liệu tham khảo).

Hình 1- Nội suy giá trị LC₅₀ bằng đồ thị (thang chia độ tuyến tính)

Hình 2 - Nội suy giá trị LC₅₀ bằng đồ thị (thang chia logarit và đơn vị xác suất)

Nếu chưa có đủ số liệu để ước tính LC₅₀ tại 24 h và 48 h và, có thể tại 72 h và 96 h, phải ghi lại nồng độ thấp nhất mà tại đó xuất hiện tỷ lệ cá chết 100 % và nồng độ cao nhất cho tỷ lệ cá chết 0 % tại 24 h; 48 h; 72 h và 96 h. Nồng độ này chỉ ra giới hạn trong đó có khả năng chứa LC₅₀.

8. Báo cáo thử nghiệm

...

...

...

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) Nhận dạng hóa chất và mọi thông tin có sẵn về chất thử (như tính tan, tính bay hơi, hệ số tỷ lệ octanol/nước, tốc độ phân hủy);

c) Phương pháp chuẩn bị nước pha loãng, dung dịch gốc và dung dịch thử;

d) Tất cả số liệu hóa học, sinh học, vật lý liên quan đến phép thử và không được đưa ra trong tiêu chuẩn này, bao gồm các chi tiết về điều kiện thích nghi của cá thử, và khối lượng cá, tính theo gam trên lít;

e) Các số liệu được xem xét khi đánh giá tính hợp lệ của phép thử:

1) Nồng độ của oxy hòa tan,

2) Tỷ lệ chết được quan sát thấy ở cá đối chứng,

3) Tỷ lệ cá đối chứng có hành vi bất bình thường,

4) LC₅₀ của chất chuẩn;

...

...

...

g) Các giá trị LC₅₀ và giới hạn tin cậy, nếu có, của chất thử tại 24 h, 48 h, 72 h và 96 h, tài liệu tham khảo cần có cho các phương pháp tính toán, và các phương pháp phân tích hóa học, ở bất cứ nơi nào được áp dụng;

h) Độ dốc của đường cong nồng độ - đáp ứng (và giới hạn tin cậy 95 % nếu có);

i) Minh họa bằng đồ thị các mối tương quan nồng độ - đáp ứng;

j) Mọi phản ứng bất thường của cá trong điều kiện phép thử và mọi tác động bên ngoài quan sát được sinh ra do chất thử;

k) Mọi sai khác so với quy trình được qui định trong tiêu chuẩn này, và nguyên nhân.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông số môi trường để nuôi và tạo giống cá ngựa vằn

...

...

...

A.1. Khái quát

Cá ngựa vằn có nguồn gốc từ bờ biển Coromandel của Ấn Độ nơi có các dòng chảy mạnh. Đây là loại cá thường được nuôi trong bể, vì thế các thông tin về các quy trình chăm sóc và nuôi cá có thể được nêu trong các tài liệu tham khảo về nuôi cá nhiệt đới. Đặc tính sinh học của các loài này đã được tổng kết bởi Laale [5].

Loài cá này hiếm khi dài quá 45 mm. Thân hình trụ với 7 đến 9 sọc dọc xanh đậm trên nền màu bạc. Các sọc này chạy đến vây đuôi và vây bụng. Phần lưng có màu xanh ô liu. Con đực mảnh hơn con cái và có màu ánh vàng. Con cái có màu bạc hơn và bụng phồng to, đặc biệt là trước khi đẻ trứng.

A.2. Thông số môi trường

Loài cá này có khả năng chịu đựng khoảng rộng về nhiệt độ, pH và độ cứng của nước. Axelrod^[4] đưa ra khoảng nhiệt độ là 15,5 °C đến 43,3 °C và pH từ 6,6 đến 7,2. Cá có thể sinh sản, nuôi và sống trong nước vòi có độ cứng tổng số cao nhất là 300 mg/l (theo canxi cacbonat) và pH từ 7,7 đến 8,2. Nhiệt độ được duy trì ổn định ở 26 °C ± 1 °C và tăng lên 27 °C ± 1 °C để kích thích đẻ trứng.

A.3. Vật liệu và phương pháp

Loài cá này có thể đẻ trứng trong bể thủy tinh có mức chứa khoảng 70 l. Cá mới nở sau đó được chuyển sang bể có mức chứa 200 l.

Vì cá trưởng thành là loài tham ăn trứng, cần có phương pháp để bảo vệ trứng mới đẻ và cá non. Một phương pháp đã được sử dụng thành công bằng cách giam cá trưởng thành trong lồng lưới dưới nước để khi con cái đẻ trứng, trứng sẽ rơi qua lưới xuống đáy bể tránh xa các con trưởng thành.

Lồng lưới có kích thước là 250 mm x 250 mm x 80 mm, được làm từ sợi nhựa, có đường kính mắt lưới 3 mm. Lồng này được kẹp vào miệng bể để phần gờ phía trên của lồng ở trên nước còn lưới nhúng xuống nước khoảng 60 mm. Không sử dụng hệ thống lọc bằng sỏi ở đáy để làm sạch nước vì nó có khả năng làm hại trứng. Bể phải được chiếu sáng 8 h một ngày.

...

...

...

Giai đoạn này kéo dài khoảng 2 tuần. Con đực và con cái được cách ly và nuôi ăn thức ăn sống. Bao gồm giun trắng (enchytraeids), Daphnia và tôm biển (Artemia). Mật độ của bể trong quá trình quy định luôn được giữ dưới 30 con cá trong bể có mức chứa 70 l.

Vào cuối của 2 tuần, con đực có màu ánh vàng đậm và con cái có bụng trứng to.

A.5. Giai đoạn đẻ trứng

Có thể thiết lập bể đẻ trứng như sau.

Làm đầy bể rỗng bằng nước vòi sạch có nhiệt độ 27 °C trong 48 h và đặt lồng nhựa vào dưới mép bể, để cá bơi trong một khoảng thể tích 1 I. Cho vào lồng sáu con cái vào buổi sáng và cho ăn bằng tôm biển đã đông khô.

Thêm chín con đực vào lồng vào buổi tối và cho cá ăn một lần nữa bằng tôm biển đã đông khô trước khi tắt đèn.

Quá trình đẻ trứng được kích thích bằng ánh sáng buổi sáng và hoàn thành sau khi bật đèn khoảng 4 h. Trứng, không dính vào nhau, rơi qua lưới, cách biệt với các con trưởng thành.

Khi con cái đẻ trứng xong, chuyển các con trưởng thành ra và đẻ cho trứng nở.

A.6. Phát triển cá con

...

...

...

Các nghiên cứu khác (xem tài liệu tham khảo [7] trong thư mục tài liệu tham khảo) chỉ ra rằng các yếu tố trong chế độ ăn có thể dẫn đến dị hình và cá ngựa vằn đặc biệt nhạy cảm với yếu tố này (các loài khác sinh sản và phát triển bình thường khi cho ăn thức ăn cá đã đăng ký phù hợp tương tự).

Phụ lục B

(Tham khảo)

Mẫu gợi ý để ghi số liệu

Phòng thử nghiệm

Người thực hiện

Ký hiệu mẫu

Ngày bắt đầu phép thử

...

...

...

Độ tinh khiết

Tạp chất

Nếu thử một phương thức, nhận dạng các thành phần

Phương pháp chuẩn bị dung dịch gốc

Nồng độ dung dịch gốc (mg/l)

Nồng độ tối đa dung môi trong các bình thử (mg/l)

Phương pháp phân tích hóa học

Bình đối chứng

1  Chỉ có nước pha loãng

...

...

...

Thời gian bắt đầu phép thử (h)

0

...

...

...

pH

Nhiệt độ (°C)

Số cá chết

...

...

...

2  Nước pha loãng và

mg/l    

  dung môi

Thông số xác định

Thời gian bắt đầu phép thử (h)

...

...

...

Nồng độ oxy hòa tan (% ASV¹⁾) pH

Nhiệt độ (°C)

...

...

...

Ký hiệu bình thử

...

...

...

mg/l  

Thông số xác định

Thời gian bắt đầu phép thử (h)

0

...

...

...

Nồng độ chất thử [mg/l (trong phân tích)]

Nồng độ oxy hòa tan (% ASV ¹⁾)

pH

Nhiệt độ (°C)

...

...

...

¹⁾ Giá trị bão hòa khí.

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2]  Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F.A simplified method for evaluating dose-effect experient. J. Pharmacol.Exp.Ther. 96 (1949), pp 99-113.

[3]  Stephan, C.E. Method for calculating an LC₅₀. Aquatic Toxycology and Hazard Evaluataion. ASTM (1977), ST, p 634.

[4]  Axelrod, H.P. Breeding Quarium Fishes Book 1. T.F.H. Publication, 1967.

[5]  Laale, H.W. The biology and use of zebra fish (Brachydanio rerio) in fisheries rearch. A literature review. J. Fish Biol. 10 (2) (1977), pp 121-173.

[6]  Mertens, J. Year-round controlled mass reproduction of zebra fish. Aquaculture 2 (1973), pp 245-249.

[7]  Newsome, C.S. and Piron, R.D. Aetiology of skeletal deformities in the Zebra Danio fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). J. Fish Biol. 21 (1982), pp 231-237.

[8]  NIIMI,A.J and LAHAM, Q.N. Influence of breeding time interval on egg number, mortality and hatching of the zebra fish (Brachydanio rerio). Can. J.Zool. 52 (1974), pp 515-517.

[9]  PIRON, R.D. Spontaneous skeletal deformities in the zebra fish (Brachydanio rerio) bred for fish toxicity tests. J. Fish Biol. 13 (1978), pp 79-84.

1) Ngoài Brachydanio rerio, có thể sử dụng các loài cá nước ngọt sau mà không sửa đổi tiêu chuẩn này.

...

...

...

- Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)

- Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)

- Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10806 -1:2015 (ISO 7346-1:1996) về Chất lượng nước - Xác định độc tính gây chết cấp tính của các chất đối với cá nước ngọt [brachydanio rerio hamilton-buchanan (teleostei, cyprinida] - Phần 1: Phương pháp tĩnh