Bảng 2 - Chu kì luân nhiệt của phản ứng RT PCR

Bước

Nhiệt độ/thời gian

Số chu kỳ

Tạo cADN

45 oC/45 min

Biến tính

94 oC/2 min

...

...

...

Biến tính

94 oC/40 s

Kéo dài mạch

55 oC/40 s

Kéo dài mạch

72 ºC/40 s

72 ºC/5 min

...

...

...

Giữ ổn định

4 ºC

Giữ ổn định

CHÚ Ý: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

CẢNH BÁO: Do bản chất của ARN là rất dễ bị phân huỷ trong môi trường cũng như enzymARNase tiết ra từ các vi sinh vật, môi trường chai, lọ, thiết bị, dụng cụ và dung dịch. Enzym ARNase rất bền, khó bị phân huỷ bởi nhiệt độ. Vì vậy, tất cả mọi dụng cụ, thiết bị, thuốc thửdùng trong RT PCR phải tuyệt đối vô trùng.

3.2.1.5.3 Chạy điện di

3.2.1.5.3.1 Chuẩn bị bản gel

Pha thạch nồng độ từ 1,5 % đến 2 % agarose bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.

Sau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, đợi đến khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 oC đến 50 oC, cho vào 5 µl ethidi bromua/100 ml. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để ethidi bromua tan đều.

...

...

...

Chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch đã đun agaroza) vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel.

3.2.1.5.3.2 Điện di

Hút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào một giếng trên bản gel.

Khi thực hiện điện di, chạy kèm theo AND marker để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang ADN vào một giếng trên bản gel.

Điện di ở hiệu điện thế 100 volt đến 150 volt (quan sát thấy bóng khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện). Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agaroza, dừng quá trình điện di.

CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di nhỏ 2 µl loading dye 6X lên giấy parafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra, nhỏ vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10 µl nhỏ vào một giếng trên bản gel.

3.2.1.5.4 Đọc kết quả

Sau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm.

Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang ADN, mẫu kiểm chứng dương tính và mẫu kiểm chứng âm tính để đưa ra kết luận.

...

...

...

Giếng

Vạch 427 bp

Kết quả

Thang ADN

Các vạch sáng rõ ràng

Điện di tốt

Mẫu kiểm chứng âm tính

Không

Không ngoại nhiễm

...

...

...

Bi ngoại nhiễm

Mẫu kiểm chứng dương tính

Có

Hỗn hợp phản ứng RT-PCR tốt

Không

Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng hoặc enzym hỏng

Mẫu thử

Có

Dương tính với VNN

...

...

...

Âm tính với VNN

Kết quả mẫu thử dương tính khi: Xuất hiện vạch sáng có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 427 bp, thang ADN phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm không có vạch sáng.

Kết quả mẫu thử âm tính khi không có vạch sáng kích thước 427 bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, có vạch sáng mẫu đối chứng dương tính. Thang ADN phân vạch rõ ràng.

3.2.2 Phương pháp mô học

3.2.2.1 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước cóđộ tinh khiết tương đương không có ARNase, trừ khi có quy định khác.

- Dung dịch Bouin (xem A.1);

- Dung dịch formalin 10 % (có bổ sung 2 % muối) (xem A.2);

- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.3);

...

...

...

- Cồn 70 %, 75 %, 90 % và cồn tuyệt đối;

- Parafin;

- Xylen;

- Keo dán, ví dụ Bom Canada.

3.2.2.2 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:

- Kính giải phẫu.

- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen.

- Lọ nhỏ cố định mẫu.

...

...

...

- Bộ phận làm lạnh mẫu.

- Máy cắt mẫu microtome.

- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ.

- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu.

- Kính hiển vi quang học.

- Cassete.

- Khung đúc mẫu.

3.2.2.3 Lấy mẫu

Thu những mẫu cá có dấu hiệu không bình thường, Cá giống bỏ ăn, cá chết rải rác, bơi không bìnhthường, bơi lội mạnh không định hướng, đầu lao xuống dưới. Không dùng cá chết hoặc cá bảo quảnđá để cắt mô.

...

...

...

3.2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu

Đối với cá lớn lấy phần đầu hoặc não, mắt cắt thành những lát mỏng (0,5 cm) trước khi ngâm trongdung dịch cố định formalin 10 % (có bổ sung 2 % muối) hoặc dung dịch Bouin ở nhiệt độ phòng. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10, ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó chuyển sang dung dịch bảo quản là cồn 70 %.

Đối với cá bột có thể cố định cả con, cá giống lấy phần đầu hoặc não, mắt ngâm trong dung dịch cố định từ 12 h đến 24 h. Sau đó cố định trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.

3.2.2.4.2 Khử mẫu cố định

Ngâm trong cồn 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong cồn tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần.

3.2.2.4.3 Làm trong mẫu

Ngâm sang lọ xylen 1 để trong 30 min đến 60 min. 

Ngâm sang lọ xylen 2 để trong 30 min đến 60 min.

Sau đó ngâm tẩm parafin hai lần, mỗi lần 56 ºC đến 58 ºC trong 1 h.

...

...

...

3.2.2.4.4 Cắt mẫu

Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá.

Đặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước từ 30 ºC đến 35 ºC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô.

3.2.2.4.5 Nhuộm tiêu bản H&E

Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượt trong cồn tuyệt đối, cồn 90 % và cồn 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.

Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ cồn 75 %, cồn 90 % và cồn tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, vídụ Bom Canada. Để khô và soi kính.

3.2.2.4.6 Đọc kết quả

...

...

...

Tổ chức não và mắt của cá bị bệnh xuất hiện nhiều không bào màu trắng và xám có đường kính từ 5 µm đến 10 µm. Trong mô não và mắt cá cũng tồn tại hiện tượng hoại tử, sự xâm nhập của các tế bào máu vào các vùng mô bị hoại tử.

4. Kết luận

Cá được xác định nhiễm bệnh VNN khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng và kết quả dương tính thu được từ một trong hai phương pháp sau:

- Phản ứng RT PCR phát hiện vi rút dương tính;

- Mẫu cắt mô có bệnh tích của vi rút VNN.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THUỐC THỬ

...

...

...

Axit picric (dung dịch bão hoà):                      750 ml

Formalin (formaldehyd 37 %) :                       250 ml

Axit axetic đậm đặc:                                       50 ml

A.2 Dung dịch formalin 10 % (có bổ sung 2 % muối)

Formalin (formaldehyd 37 %):                        100 ml

Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4):                6,5 g

Natri hydro phosphat (NaH2PO4):                  0,4 g

Natri clorua (NaCl):                                         20 g

Nước:                                                             900 ml

...

...

...

Hematoxylin dạng tinh thể:                             1 g

Natri iodat:                                                       0,2 g

Amoni alum [NH4Al(SO4)2] hoặc kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g

Axit axetic:                                                      1 g

Cloral hydrat:                                                  50 g

Nước:                                                             1000 ml

Hoà tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum hoặc kali alum, hoà tan, tiếp tục cho axit axetic và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.4 Thuốc nhuộm eosin

...

...

...

Cồn 70 %:                                                       1 lít

Axit axetic băng:                                             5 ml

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào cồn 70 %. Hoà tan eosin trong cồn, sau đó cho thêm axitaxetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bùi Quang Tề và cộng sự. 1998., Bệnh học thủy sản.

[2] Danayadol, Y., Direkbusarakom, S. and Supamattaya, K., 1995. Viral nervous necrosis in brownspotted grouper, Epinephelus malabaricus, cultured in Thailand. In: Diseases in Asian Aquaculture II, M. Shariff,

[3] Frerichs G.N., Tweedie A.; Starkey W.G.; Richards R.H., 2000. Temperature, pH, and electrolyte sensitivity, and heat, UV and disinfectant inactivation of sea bass (Dicentrarchus labrax) neuropathy nodavirus. Aquaculture. 185: p. 13-24.

...

...

...

[5] Iwamoto, T., Nakai, T., Mori, K., Arimoto, M., Furusawa, I., 2000. Cloning of the fish cell line SSN-1 for piscine nodaviruses. Diseases of Aquatic Organisms. 43: p. 81- 89.

[6] Johansen, R., Grove, S., Svendsen, A.K., Modahl, I., Dannevig, B.H, A., 2004. Sequential study of pathological findings in Alantic halibut, Hippoglossus hippoglossus (L.), throughout one year after an acute outbreak of viral encephalopathy and retinopathy. Journal of Fish Diseases. 27: p. 327-341.

[7] Mladineo, I., 2003. The immunohistochemical study of nodavirus changes in larval, juvenile and adult sea bass tissue. Journal Applied Ichthyology. 19: p. 366-370.

[8] Mori, K., Mangyoku, T., Iwamoto, T., Arimoto, M., Tanaka, S., Nakai, T., 2003. Serological relationships among genotypic variants of Betanodavirus. Diseases of Aquatic Organisms. 57: p. 19-26.

[9] Munday, B.L., Kwang, J., Moody, N., 2002. Betanodavirus infections of teleost fish: a review. Journal of Fish Diseases, 25: 127-142.

[10] Nishizawa, T., K. Mori, T. Nakai, I. Furusawa, and K. Muroga. 1994. Polymerase chain reaction (PCR) amplification of RNA of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV). Dis. Aquat. Org. 18:103-107.

[11] Nishizawa, T., Furuhashi, M., Nagai, T., Nakai, T., Muroga, K., 1997. Genomic classification of  fish nodaviruses by molecular phylogenetic analysis of the coat protein gene. Applied and  Environmental Microbiology. 64: p. 1633-1636

[12] Sohn, S.G. and Park, M.A., 1998. Viral diseases of cultured marine fish and shrimp in Korea. Fish  Pathology. 33 : p. 189-192.

[13] Tanaka, S., Takagi, M., Miyazaki, T.,2004. Histopathological studies on viral nervous necrosis of  sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus Thunburg, at the grow-out stage. Journal of  Fish Diseases. 27: p. 385-399.

...

...

...

[15] Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals, 2006. Viral encephalopathy and retinopathy

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8710-2:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 2: bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển