- Xác định đặc tính lên men đường sucrose, lactose, sinh H2S theo quy định tại Phụ lục A. 

- Xác định đặc tính lên men đường manitol theo quy định tại Phụ lục A. 

- Khả năng phân giải ure theo quy định tại Phụ lục A.

Bảng 2: Đặc tính sinh hóa của E. coli (ph n ng IMViC)

 Vi khuẩn

Sinh indol (I)

Đỏ metyl (M)

Voges-Proskauer (V)

Khả năng sử dụng xitrat (C)

...

...

...

+

+

-

-

Xác định đặc tính sinh hóa theo quy định tại Phụ lục A.

5.2.3 Xác định gene quy định yếu tố độc lực F18 và VT2e

Sử dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) với các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện genemã hóa cho yếu tố bám dính F18 và toxin VT2e như trong Bảng 3.

Bảng 3 - Các cặp mồi và chu trình nhiệt cho PCR

Gene đích

...

...

...

Sequence (5′-3′)

Kích cỡ sản phẩm (bp)

Chu trình nhiệt

F18

Fed A1

GTGAAAAGACTAGTGTTTATTTC

510

94oC, 5 min ;

FedA2 

...

...

...

Chu trình 30 vòng:

VT2e a)

VTe-a 

CCTTAACTAAAAGGAATATA

230

(94oC, 1 min;

VTe-b

CTGGTGGTGTATGATTAATA

55oC, 1 min;

...

...

...

STII-Bv1

ATGAAGAAGATGTTTATAGCG

260

72oC, 1 min)

STII-Bv2

GTTAAACTTCACCTGGGCAAAG

72oC, 7 min. Giữ: 4oC

a) Để phát hiện gene VT2e, có thể sử dụng một trong hai cặp mồi này.

...

...

...

6. Kết luận

Lợn được xác định là mắc bệnh phù (phù đầu) khi:

Có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh và phân lập được vi khuẩn

E. coli mang yếu tố độc lực F18 và VT2e.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA

A.1 Đặc tính lên men đường sucrose, lactose, manitol, sinh H2S và phân giải ure

...

...

...

A.1.1.1 Môi trường

Chuẩn bị môi trường TSI hay Kligler (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

Thạch nghiêng chế từ Kligler hoặc TSI. Thạch màu đỏ và có 2 phần: phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng lên men đường glucoza, sinh hơi, sinh H2S, phần thạch nghiêng để kiểm tra khả năng lên men đường lactoza.

A.1.1.2 Tiến hành

Lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa phần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm, rút dần que lên và tiếp tục cấy trên bề mặt nghiêng, nuôi cấy ở 37 oC trong điều kiện hiếu khí, sau 24 h kiểm tra.

A.1.1.3 Đọc kết quả

Lên men đường lactoza:

- Dương tính: Mặt nghiêng màu vàng;

- Âm tính: Mặt nghiêng màu hồng.

...

...

...

- Dương tính: Phần thạch đứng màu vàng;

- Âm tính: Phần thạch đứng màu hồng.

Khả năng sinh H2S:

- Dương tính: đáy ống nghiệm có màu đen;

- Âm tính: đáy ống nghiệm không có màu đen.

Khả năng sinh hơi:

- Dương tính: Thạch trong ống nghiệm bị nứt hay có bọt khí;

- Âm tính: Thạch trong ống nghiệm không bị nứt hay có bọt khí.

A.1.2 Lên men đường manitol

...

...

...

Pha nước pepton theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

Chuẩn bị chỉ thị màu Andrade

Thành phần:

Fuchsin axit                                                           0, 5 g

Nước                                                                     100 ml

NaOH 1 N

Cách pha: Nghiền fuchsin, hoà vào nước cho tan hết. Cho từ từ lượng dung dịch NaOH 1 N, vừa cho vừa lắc đến khi chuyển màu từ đỏ tươi sang đỏ nâu, đến vàng úa, vàng thẫm thì dừng (thường từ 12 ml đến 17 ml). Để lắng từ 1 h đến 2 h, lọc qua giấy lọc. Hấp 120 oC trong 15 min.

Cho 1 ml chỉ thị màu Andrade vào 100 ml môi trường nước pepton, chia ra các ống (4 ml mỗi ống). Hấp 120 0C trong 30 min.

Chuẩn bị đường: pha đường thành dung dịch 10 % (trong nuước cất) hấp 110 0C trong 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần 100 oC trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc 0,45 µm.

...

...

...

A.1.2.2 Phương pháp kiểm tra và đọc kết quả

Cấy vi khuẩn đã nuôi cấy thuần khiết vào các ống môi trường nước pepton có đường, để vào tủ ấm 37 oC, sau 24 h đọc kết quả.

- Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi màu.

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu đỏ.

A.1.3 Phân giải urê

Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (Urea agar base - Christensen) chế môi trường và bổ sung urê theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Cấy vi khuẩn vào môi trường có urê, nuôi cấy ở 37oC, đọc kết quả sau 24 h.

- Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi màu.

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu tím.

...

...

...

A.2.1 Phản ứng sinh indol

Thành phần thuốc thử Kovac’s

Paradimetylaminobenzaldehyde                   5 g

Amyl alcohol (cồn amyl)                                75 ml

HCl đặc                                                          25 ml

Cách pha: cho Paradimetylaminobenzaldehyde vào cồn để vào nước ấm 50 đến 55 oC, lắc đều cho tan, để nguội hoàn toàn, hay lạnh (4 oC), cho từ từ HCl đặc, vừa cho vừa lắc.

Bảo quản thuốc thử ở nhiệt độ lạnh khoảng 4 oC trong lọ màu.

Cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton hoặc môi trường nước pepton có bổ sung tryptophan, ủ ở 37 oC. Sau 24 h, nhỏ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ.

- Phản ứng dương tính: trên bề mặt môi trường vòng thuốc thử chuyển màu đỏ.

...

...

...

A.2.2 Phản ứng MR

Thuốc thử phản ứng MR

Đỏ metyl                                                         0,04 g

Cồn 95 độ                                                      60 ml

Nước                                                              40 ml

Môi trường VP-MR pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Cấy vi khuẩn vào môi trường nước VP-MR, nuôi ở 37oC sau 24 h nhỏ vào môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn mẫu 5 giọt dung dịch thuốc thử, đọc kết quả sau 5 min.

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu đỏ

- Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng.

...

...

...

Pha môi trường VP-MR: Theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Pha thuốc thử

- Dung dịch 1:

Alpha naphthol (C10H7OH)                                       5 g

Cồn 96 %                                                                100 ml

- Dung dịch 2:

KOH                                                                        40 g

Nước                                                                       100 ml

Tiến hành phản ứng: Cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường VP-MR, nuôi cấy ở 37 oC, sau 48 h nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 0,6 ml dung dịch 1 và 0,2 ml dung dịch 2. Đọc kết quả sau 15 min và 1 h.

- Phản ứng dương tính: Môi trường có màu đỏ hồng đậm.

...

...

...

A.2.4 Sử dụng xitrat

Pha chế môi trường (thạch simon xitrat) theo quy định của nhà sản xuất. Cấy vi khuẩn vào thạch simon xitrat nuôi ở 37 0C từ 18 h đến 24 h. Vi khuẩn sử dụng xitrat (dương tính) làm môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển. Âm tính khi môi trường giữ nguyên màu xanh lá cây.

PHỤ LỤC B

(Quy định)

PHƯƠNG PHÁP PCR GIÁM ĐỊNH GENE QUY ĐỊNH YẾU TỐ ĐỘC LỰC F18 VÀ VT2E

B.1 Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra có thể là khuẩn lạc hay canh khuẩn nuôi cấy từ 18 h đến 24 h. Hòa khuẩn lạc nghi ngờ trực tiến vào hỗn hợp phản ứng PCR hoặc cho 2 µl nước canh khuẩn.

Mẫu đối chứng dương: Chủng vi khuẩn E. coli đã biết có mang gene F18 và VT2e.

...

...

...

Tách chiết bằng phương pháp shock nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc hòa vào 100 l nước vô trùng không chứa men Rnase và Dnase (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min, rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch 12000 r/min trong 5 min. Thu hoạch nước trong để làm phản ứng PCR.

B.2 Tiến hành phản ứng PCR

Có thể dùng các kit PCR thương mại và sử dụng kết hợp với hướng dẫn của nhà sản xuất.

Nếu sử dụng Taq DNA polymerase của hãng QIAGEN thì thành phần cho 1 phản ứng PCR với tổng thể tích là 50 ml bao gồm: 10X coral bufer: 5 ml; 200 mM mỗi loại dNTP; Taq DNA polymerase 2,5 UI; primer forward và primer reverse 1 mM mỗi loại; nước cất tiệt trùng; DNA tách chiết từ mẫu (2 ml) hoặc khuẩn lạc hay canh trùng vi khuẩn.

Đối chứng dương: Vi khuẩn hay DNA tách chiết từ vi khuẩn E. coli đã biết có mang gene F18 và VT2e.

Đối chứng âm: bao gồm đầy đủ thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có DNA tách chiết từ mẫu hay vi khuẩn.

B.3 Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Cho 2 ml dung dịch loading dye vào 8 ml sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 ml thang chuẩn (marker) vào một giếng.

...

...

...

Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm DNA để pha chế thạch agarose (ví dụ như SYBR safe DNA gel stain của hãng Invitrogen) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

B.4 Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-16:2011 về bệnh động vật - quy trình chẩn đoán - phần 16: bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E. Coli