5.3.2.3 Giám định sinh hoá và định typ huyết thanh - Phản ứng oxidase (xem Phụ lục C).

- Phản ứng urease dương tính (xem Phụ lục C).

- Nếu phân lập được vi khuẩn, đem thử lại bằng phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu của từng chủng riêng biệt và làm các phản ứng sinh hóa.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THUỐC THỬ

A.1 Dung dịch EDTA-PBS pH 7,2

Natri clorua (NaCl)                                                               8,0 g

...

...

...

Dinatri hydrophosphat (Na2HPO4)                                       1,15 g

Kali dihydrophosphat (KH2PO4)                                           0,20 g

EDTA                                                                                    3,72 g

Nước     1 000 ml

PHỤ LỤC B

(Quy định)

CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM

B.1 Phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen

...

...

...

Bước 2: Nhỏ ngập tiêu bản bằng Carbol Fuchsin. Hãy đảm bảo thuốc nhuộm luôn được phủ kín trong suốt quá trình nhuộm.

Bước 3: Sử dụng đèn Bun-sen (đèn khí đốt hình ống như dùng trong phòng thí nghiệm), làm nóng tiêu bản một cách từ từ cho tới khi nóng và duy trì trong 5 min bằng cách sử dụng nhiệt độ thấp hoặc làm nóng gián đoạn.

CHÚ Ý: Nếu hơ lửa quá nóng có thể làm vỡ phiến kính. Bước 4: Rửa tiêu bản bằng nước.

Bước 5: Nhỏ ngập tiêu bản với axit-alcohol 3 % trong 5 min (tẩy màu). Trong 5 min đó, có thể nhỏ thêm axit-alcohol 3 % cho tới khi tiêu bản được tẩy sạch.

Bước 6: Rửa sạch tiêu bản với nước và sau đó làm khô tiêu bản.

Bước 7: Nhỏ ngập tiêu bản bằng phẩm màu xanh metylen và giữ trong khoảng 1 min.

Bước 8: Rửa sạch tiêu bản bằng nước. Toàn bộ các bước được thực hiện đúng và chính xác, kiểm tra dưới kính hiển vi với vật kính dầu thấy vi khuẩn bắt màu đỏ trên nền xanh da trời.

B.2 Phương pháp nhuộm Gram

Bước 1: Nhỏ ngập tiêu bản đã cố định bằng dung dịch tím tinh thể trong 1 min. Rửa sạch tiêu bản nhanh dưới vòi nước (không quá 5 s). Lau khô.

...

...

...

Bước 3: Nhỏ ngập tiêu bản với cồn 95 % trong 10 s (có thể lâu hơn nếu tiêu bản bắt màu quá đậm) và rửa sạch bằng vòi nước. Lau khô tiêu bản.

Bước 4: Nhỏ ngập tiêu bản bằng dung dịch hữu cơ màu đỏ trong 30 s. Rửa sạch dưới vòi nước. Lau khô tiêu bản bằng giấy thấm nước nhưng không làm bay mất lớp cố định.

Bước 5: Kiểm tra tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính dầu.

PHỤ LỤC C

(Quy định)

CÁC PHẢN ỨNG SINH HOÁ

C.1 Phân giải urê

Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (urea agar base - Christensen) (chuẩn bị môi trường và bổ sung urê theo chỉ dẫn của nhà sản xuất).

...

...

...

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu tím.

C.2 Phản ứng oxidaza

Phản ứng được tiến hành trên giấy có tẩm dung dịch 1 % tetra methyl p-phenyl diamin HCl. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch chà sát lên trên mặt giấy. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đen tím sau 30 s. Phản ứng âm tính khi giấy tẩm giữ nguyên màu.

PHỤ LỤC D

(Quy định)

CHUẨN ĐỘ CÁC DUNG DỊCH CỦA PHƯƠNG PHÁP CFT

D.1 Chuẩn độ kháng nguyên Brucella

Cho 50 ml nước muối sinh lý vào tất cả các lỗ của đĩa nhựa 96 giếng chữ U. Cho 50 ml huyết thanh dương pha loãng 1/ 2,5 vào các lỗ cột 1.

...

...

...

Dùng 8 ống nghiệm pha loãng kháng nguyên cần kiểm tra bắt đầu từ hiệu giá 1/ 2,5 fi 1/ 5 fi 1/10 … fi 1/320

Cho 50 ml kháng nguyên ở ống 8 vào các lỗ ở hàng H, ống 7 vào hàng G, ống 6 vào hàng F… ống 1 vào hàng A, trộn đều và ủ ấm 37 ⁰C qua đêm.

Đọc kết quả: Nếu ở độ huyết thanh pha loãng nhất vẫn ngưng kết với các nồng độ kháng nguyên khác nhau thì bất cứ nồng độ kháng nguyên nào trong khoảng đó đều có thể chọn làm nồng độ chuẩn cho phản ứng. Thông thường chọn độ pha loãng hơi đậm hơn so với độ pha loãng cao nhất của kháng nguyên làm dung dịch kháng nguyên chuẩn cho chẩn đoán.

VÍ DỤ: Ở độ pha loãng huyết thanh 1/1280, tất cả các nồng độ pha loãng kháng nguyên từ 1/5 fi 1/40 đều cho phản ứng ngưng kết, nên chọn độ pha loãng 1/30 của kháng nguyên làm dung dịch chuẩn.

D.2 Chuẩn độ dung huyết tố

Pha loãng dung huyết tố ở nồng độ 1/10 ( (0,1 dung huyết tố + 0,9 ml VBS). Từ nồng độ 1/10, pha một dãy các nồng độ khác nhau như sau:

Ống

Độ pha loãng

Dung huyết tố

...

...

...

1

1/100

0,2 của nồng độ 1/10

1,8

2

1/250

0,2 của nồng độ 1/100

0,3

3

...

...

...

0,4 của nồng độ 1/100

1,6

4

1/750

0,2 của nồng độ 1/100

1,3

5

1/1000

0,2 của nồng độ 1/100

...

...

...

6

1/1500

0,2 của nồng độ 1/500

0,4

7

1/2000

0,2 của nồng độ 1/500

0,6

8

...

...

...

0,2 của nồng độ 1/500

0,8

9

1/3000

0,2 của nồng độ 1/1000

0,4

10

1/4000

0,2 của nồng độ 1/1000

...

...

...

11

1/5000

0,2 của nồng độ 1/1000

0,8

12

1/6000

0,2 của nồng độ 1/1000

1,0

Chuyển 30 ml của mỗi nồng độ pha loãng dung dịch dung huyết tố sang một dãy ống nghiệm tương ứng. Thêm 30 ml của hỗn dịch hồng cầu cừu (SRBC) 3 %.

...

...

...

Trộn đều và thêm 50 ml dung dịch chứa dung huyết tố và hồng cầu cừu (pha loãng theo các nồng độ), trộn và đặt vào tủ ấm 37 ⁰C trong 30 min (sau mỗi 15 min bỏ ra trộn một lần và lại đặt vào tủ ấm), sau 30 min lấy ra khỏi tủ ấm và lại trộn đều.

Đánh giá kết quả chuẩn độ dung huyết tố.

VÍ DỤ: Từ lỗ 1 đến lỗ 9 có nhiều dung huyết tố làm tan hết hồng cầu cừu. Từ lỗ 10 đến lỗ 12 ít dung huyết tố do đó không tan hết hồng cầu cừu. Do vậy, lấy lỗ thứ 8 vì tại lỗ thứ 8 hồng cầu cừu tan hết. Lỗ thứ 8 tương ứng với độ pha loãng 1/2500 = MHD (Minimum Haemolytic Dose - liều tối thiểu gây dung huyết), làm phản ứng cần 5 MHD, do đó:

1/2500 x 5 = 1/500 (lấy haemolysin ở nồng độ pha loãng 1/500 để làm phản ứng).

D.3 Chuẩn độ bổ thể

Bổ thể pha loãng ở nồng độ 1/10 (0,5 ml bổ thể + 4,5 ml dung dịch muối đệm Veronal). Từ nồng độ pha loãng 1/10 tiến hành pha loãng một dãy bổ thể như sau: 

Ống

Độ pha loãng

Bổ thể 1/10

...

...

...

1

1/20

0,2 ml

0,2

2

1/30

0,2 ml

0,4

3

...

...

...

0,2 ml

0,6

4

1/50

0,2 ml

0,8

5

1/60

0,2 ml

...

...

...

6

1/70

0,2 ml

1,2

7

1/80

0,2 ml

1,4

8

...

...

...

0,2 ml

1,6

9

1/100

0,2 ml

1,8

10

1/120

0,2 ml

...

...

...

11

1/150

0,2 ml

2,8

Lấy  25 ml  (1 giọt) của mỗi nồng độ bổ thể pha loãng cho vào một dãy  11 lỗ của đĩa nhựa  96 lỗ (microtitre plate). Cho 25 ml dung dịch muối đệm Veronal vào lỗ 12 (được coi là đối chứng).

Thêm 25 ml dung dịch muối đệm Veronal vào tất cả các lỗ.

Trộn đều và đặt vào tủ ấm 37 ⁰C trong 30 min.

Thêm 25 ml hệ thống dung huyết vào tất cả các lỗ. Trộn đều và đặt vào tủ ấm 37⁰C trong 30 min.

Để ở nhiệt độ phòng một số thời gian (hoặc đặt trong tủ lạnh một đêm) trước khi đọc kết quả. Đánh giá kết quả chuẩn độ bổ thể:

...

...

...

+: 75 % dung huyết, 25 % có sự kết hợp.

+: 50 % dung huyết, 50 % có sự kết hợp.

+++: 25 % dung huyết, 75 % có sự kết hợp.

++++: không có hiện tượng dung huyết.

Kết quả chuẩn độ bổ thể:

Lỗ

1

2

3

...

...

...

5

6

7

8

9

10

11

12

Độ pha loãng

...

...

...

1/30

1/40

1/50

1/60

1/70

1/80

1/90

1/100

1/120

...

...

...

Đối chứng

Kết quả

-

-

-

-

+

+

+

...

...

...

Từ bảng trên: 1 MHD = 1/60 pha loãng bổ thể. 

Sử dụng trong phản ứng dùng:

(1 + 1/4) MHD = 5/4 x 1/60 = 1/48 pha loãng bổ thể.

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-13:2011 về bệnh động vật - quy trình chẩn đoán - phần 13: bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucela