Công thức Reed & Muench:

Như vậy, liều gây chết 50% phôi trứng là 10 -7,7.

Tính chỉ số trung hòa:

Nồng độ vi rút (log₁₀)

Số trứng chết / số trứng tiêm

log₁₀ELD₅₀

Đối chứng dương tính

-1

...

...

...

-3

-4

-5

-6

-7

-8

6,5

Đối chứng âm tính

5/5

...

...

...

0/5

5/5

4/5

1/5

0/5

2,5

Kết quả: NI = 6,5 - 2,5 = 4,0

Kết luận: bệnh phẩm dương tính vi rút dịch tả vịt.

...

...

...

PHỤ LỤC C

(Quy định)

PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH VI RÚT DỊCH TẢ VỊT TRÊN TẾ BÀO

C.1 Chuẩn bị tế bào xơ phôi vịt (DEF - Duck Embryo Fibroblast)

- Chọn trứng vịt có phôi từ 9 ngày tuổi đến 10 ngày tuổi, phát triển tốt. Mổ trứng, lấy phôi. - Rửa phôi trong dung dịch PBS có chứa 1 % kháng sinh.

- Cắt bỏ đầu, chân, cánh và các cơ quan phủ tạng.

- Rửa lại phôi từ 1 lần đến 2 lần trong dung dịch PBS có chứa 1 % kháng sinh. - Cắt nhỏ phôi.

- Tách tế bào bằng dung dịch trypsin ấm 0,25 % và lắc nhẹ 250 r/min trong 15 min.

- Thu hoạch tế bào đă tách bằng cách lọc qua 4 lần vải gạc, cho vào môi trường MEM.

...

...

...

- Đếm và pha loãng tế bào với môi trường phát triển (MEM + 10 % FCS), lượng tế bào cần thiết tối thiểu 4 x 105 tế bào/ml.

C.2 Phân lập vi rút dịch tả vịt trên tế bào DEF

- Cấy tế bào DEF trên các chai nuôi tế bào T25 hoặc đĩa nuôi tế bào (đĩa 6 giếng, 24 giếng), sau 2 ngày đến 3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70 %) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý, lượng 100 µl/giếng hoặc 500 µl/chai. Việc cấy chuyển 2 lần là cần thiết trong quá trình phân lập.

- Quan sát CPE trong các chai nuôi cấy thời gian 7 ngày: Vi rút dịch tả vịt gây hủy hoại tế bào sau 2 ngày đến 4 ngày. Nếu CPE đạt 70 % đến 80 % hoặc sau 7 ngày không có CPE thì tiến hành thu hoạch hỗn dịch tế bào.

- Cho các chai nuôi cấy vào nhiệt độ -20 oC đến -40 oC làm đông, sau đó giải đông, lặp lại 3 lần, cuối cùng ly tâm và thu phần nước trong để giám định vi rút hoặc cấy chuyển lần 2.

C.3 Giám định vi rút dịch tả vịt trên tế bào DEF

a) Chuẩn bị

Tế bào DEF đă nuôi cấy được 2 ngày đến 3 ngày trên đĩa nuôi tế bào 96 giếng.

Pha loãng vi rút phân lập: các nồng độ từ 10-1 đến 10-9 với môi trường nuôi cấy MEM.

...

...

...

Lô đối chứng âm tính: trộn huyết thanh âm tính với các nồng độ vi rút đă pha loãng theo tỷ lệ 1:1.

b) Tiến hành

Gây nhiễm hỗn hợp trên vào đĩa đă nuôi cấy tế bào DEF (đĩa 96 giếng), 100µ/giếng, 8 giếng/nồng độ. Ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 37 oC trong 1 h.

Đổ bỏ hỗn hợp trên, cho môi trường nuôi cấy MEM 100 µl/giếng.

Tiếp tục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 37oC, thời gian từ 7 ngày đến 9 ngày.

Hàng ngày kiểm tra CPE , thường vi rút dịch tả vịt gây hủy hoại tế bào sau 2 ngày đến 4 ngày.

c) Đánh giá kết quả

Dựa vào kết quả CPE của 2 lô để tính toán liều TCID50 và chỉ số trung hòa NI theo công thức Reed & Muench để đánh giá kết quả.

Chỉ số trung hòa NI là chênh lệch giữa TCID50 của lô đôi chứng dương tính và lô đối chứng âm tính. Kết quả dương tính khi NI ≥ 2.

...

...

...

PHỤ LỤC D

(Quy định)

PHÁT HIỆN VI RÚT DỊCH TẢ VỊT BẰNG PHẢN ỨNG PCR

D.1 Chiết tách DNA của vi rút từ mẫu bệnh phẩm

Chiết tách bằng kit theo quy trình của nhà sản xuất. Dưới đây là hướng dẫn của bộ kit chiết tách QIAamp DNeasy Blood & Tissue Mini Kit.

- Nhỏ 20 µl protease vào ống 1,5 ml.

- Nhỏ 200 µl huyễn dịch bệnh phẩm vào ống. 

- Nhỏ 200 µl dung dịch AL vào ống.

- Lắc ống trong 15 s và ly tâm ở 350g trong 15 s (spin down). - Ủ ở 56 oC trong 10 min rồi ly tâm ở 350g trong 15 s.

...

...

...

- Ly tâm cột lọc và ống thu với tốc độ 6000g trong 1 min ở nhiệt độ phòng. - Chuyển cột lọc sang ống thu mới.

- Nhỏ 500 µl dung dịch AW1 vào cột lọc, ly tâm với tốc độ 6000g trong 1 min ở nhiệt độ phòng. - Chuyển cột lọc sang ống thu mới.

- Nhỏ 500 µl dung dịch AW2 vào cột lọc, ly tâm với tốc độ 20000g trong 3 min ở nhiệt độ phòng. - Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml không có Dnase.

- Nhỏ 200 µl dung dịch AE vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 min.

- Ly tâm cột lọc và ống 1,5 ml với tốc độ 6000g trong 1 min ở nhiệt độ phòng. - Bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống 1,5 ml.

- Bảo quản ống ở 4 oC nếu làm PCR ngay, hoặc ở - 20 oC nếu làm PCR sau 24 h.

D.2 Kỹ thuật PCR

a) Pha hỗn hợp nhân gen (master mix) theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kit nhân gen PCR.

b) Sử dụng cặp mồi (primers) đặc hiệu phát hiện gen của vi rút dịch tả vịt.

...

...

...

Mồi xuôi

5'-GAA-GGC-GGG-TAT-GTA-ATG-TA-3'

Mồi ngược

5'-CAA-GGC-TCT-ATT-CGG-TAA-TG-3'

Chu trình nhân gen

1 vòng

95°C, 5 min

37°C, 1 min

...

...

...

95°C, 5 s

55°C, 30 s

72°C, 20 s

1 vòng

72°C, 7 min

Giữ ở 4oC đến khi chạy điện di

...

...

...

Pha thạch Agar 1 % bằng dung dịch đệm TAE, đun cho tan đều, khi đã nguội, đổ vào khuôn điện di (có lược) Khi thạch đã đông, để vào trong buồng điện di có đệm TAE

Các sản phẩm PCR được pha với dung dịch loading với tỷ lệ 1:10, trộn lẫn với ethidi bromua và nhỏ vào các giếng trên miếng thạch agar (10 µl/mẫu)

Chạy điện di trong 1 h ở điện thế 120 V.

Rửa bỏ thuốc nhuộm bằng cách ngâm trong nước 45 min và đọc kết quả bằng ánh sáng UV, chụp ảnh.

d) Đọc kết quả:

- Mẫu đối chứng dương và các mẫu dương tính có vạch với kích cỡ 446 bp -

Mẫu đối chứng âm và các mẫu âm tính không có vạch.

D.3 Kỹ thuật Real-time PCR

Sử dụng kỹ thuật Real-time PCR với SYBR Geen: dùng cặp mồi (primers) như trên với các nguyên liệu cho Real-time PCR, ví dụ của bộ kit QuantiFast SYBR PCR (hãng Qiagen).

...

...

...

2x Master mix                                                   12,5 µl

H₂O                                                                  6,5 µl

Mồi xuôi (20 µM)                                               0,5 µl

Mồi ngược (20 µM)                                            0,5 µl

Kết quả rPCR được hiển thị qua chương trình phần mềm của máy tính:

- Mẫu dương tính có giá trị Ct, mẫu âm tính không có.

- Mẫu đối chứng dương có giá trị Ct như đã biết qua định lượng (± 2 Ct)

- Mẫu đối chứng âm không có giá trị Ct.

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-11:2011 về bệnh động vật - quy trình chẩn đoán – phần 11: bệnh dịch tả vịt do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành