Trộn các lượng chứa trong các ống nghiệm bằng máy trộn dùng cho ống nghiệm (6.5) và đặt các ống này vào nồi cách thủy (6.8) trong 10 min, sau đó bổ sung như sau:

Chất chuẩn mẫu trắng

ml

Chất chuẩn

ml

Dung dịch làm việc trypsin (5.12)

1

1

...

...

...

Chất chuẩn mẫu trắng

ml

Chất chuẩn

ml

Axit axetic (5.7)

0

1

Trộn lượng chứa trong các ống nghiệm bằng máy trộn dùng cho ống nghiệm.

...

...

...

Đo độ hấp thụ của các dung dịch trong so với nước bằng máy đo phổ (6.6) ở 410 nm trong cuvet 10 mm (6.2).

Các dung dịch này bền được trong ít nhất 2 h.

9.5. Đo hoạt độ ức chế trypsin

Dùng pipet cho vào các ống ly tâm theo phương án sau đây.

Chuẩn bị cho mỗi độ pha loãng của dịch chiết mẫu (9.3), một dung dịch trắng tương ứng. Các dung dịch chiết mẫu và các dung dịch trắng tương ứng phải được thực hiện theo một quy trình, kể cả ly tâm.

Chất chuẩn mẫu trắng

ml

Chất chuẩn

...

...

...

Mẫu trắng

ml

Mẫu

ml

Thuốc thử L-BAPA (5.17)

5

5

5

5

...

...

...

0

0

1

1

Nước (5.1)

3

3

2

2

...

...

...

1

0

1

0

Trộn các lượng chứa trong các ống nghiệm bằng máy trộn dùng cho ống nghiệm (6.5) và đặt ống vào nồi cách thủy (6.8) trong 10 min. Bổ sung như sau:

Chất chuẩn mẫu trắng

ml

Chất chuẩn

...

...

...

Mẫu trắng

ml

Mẫu

ml

Dung dịch làm việc trypsin (5.12)

1

1

1

1

...

...

...

Chất chuẩn mẫu trắng

ml

Chất chuẩn

ml

Mẫu trắng

ml

Mẫu

ml

...

...

...

0

1

0

1

Trộn các lượng chứa trong các ống nghiệm bằng máy trộn dùng cho ống nghiệm.

Ly tâm các ống 10 min trong máy ly tâm (6.10) ở gia tốc khoảng 1 500 g_n.

Đo độ hấp thụ của các dung dịch trong suốt này so với nước bằng máy đo phổ (6.6) ở bước sóng 410 mm trong cuvet 10 mm (6.2).

Dung dịch này bền được ít nhất 2 h.

10. Tính kết quả

...

...

...

Tính phần trăm ức chế của dung dịch chiết mẫu bằng công thức:

Trong đó:

i là phần trăm ức chế, tính bằng phần trăm (%);

A_r là độ hấp thụ của dung dịch bổ sung chất chuẩn;

A_br là độ hấp thụ của mẫu trắng bổ sung chất chuẩn;

A_s là độ hấp thụ của dung dịch bổ sung mẫu;

A_bs là độ hấp thụ của mẫu trắng có mẫu.

10.2. Hoạt độ chất ức chế trypsin

...

...

...

trong đó

TIA là hoạt độ chất ức chế trypsin, tính bằng miligam trên gam (mg/g);

i là phần trăm ức chế, tính bằng phần trăm (%);

m₀ là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

m₁ là khối lượng trypsin, tính bằng miligam (mg);

f₁ là độ pha loãng của dịch chiết mẫu [(100 ml x 100 ml)/V, trong đó V là thể tích lấy từ Bảng A.1, tính bằng mililít];

f₂ là hệ số chuyển đổi (2,8 x 10^-4) tùy thuộc vào độ tinh khiết của trypsin (56%, xem [1] và [2]) và tùy thuộc vào độ pha loãng của trypsin theo 5.11 và 5.12.

Làm tròn kết quả chính xác đến 0,1 mg/g.

...

...

...

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp nêu trong Phụ lục B.

Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.

11.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại (r) được đề cập hoặc được tính từ Bảng 1.

Bảng 1 – Giới hạn lặp lại (r) và giới hạn tái lập (R)

Mẫu

Hoạt độ ức chế trypsin

mg/g

...

...

...

mg/g

R

mg/g

Đậu tương 1

Đậu tương 2

Hạt đậu tương rang

1,53

1,30

2,08

...

...

...

0,09

1,03

1,11

2,11

1,88

11.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do những người khác nhau thực hiện, trong hai phòng thử nghiệm khác nhau, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập (R) được đề cập hoặc được nêu trong Bảng 1.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra được:

...

...

...

- phương pháp lấy mẫu sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu độ lặp lại được kiểm tra thì nêu hai kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(quy định)

Phương án pha loãng dịch chiết mẫu

Bảng A.1 đưa ra phương án pha loãng cần được thực hiện. Hình A.1 và A.2 đưa ra ví dụ về phương án pha loãng.

...

...

...

TIA dự kiến

mg/g

Độ pha loãng theo lý thuyết ở các phần trăm ức chế khác nhau

40%

50%

60%

0,5

61

76

...

...

...

1,0

30

38

45

1,5

20

25

30

2,0

...

...

...

19

23

2,5

12

15

18

...

...

...

3,0

10

13

15

3,5

8,6

11

13

4,0

...

...

...

9,5

11

4,5

6,7

8,4

10

5,0

6,0

7,6

...

...

...

6

5,0

6,3

7,6

7

...

...

...

5,4

6,5

8

3,8

4,7

5,7

9

3,4

4,2

...

...

...

10

3,0

3,8

4,5

11

...

...

...

3,4

4,1

12

2,5

3,2

3,8

13

2,3

2,9

...

...

...

14

2,2

2,7

3,2

15

2,0

2,5

3,0

...

...

...

16

1,9

2,4

2,8

17

1,8

2,2

...

...

...

18

1,7

2,1

2,5

19

1,6

2,0

2,4

20

...

...

...

1,9

2,3

25

1,2

1,5

1,8

Hình A.1 – Mối quan hệ giữa hoạt độ ức chế trypsin và độ pha loãng mẫu theo lý thuyết

...

...

...

Phụ lục B

(tham khảo)

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Độ chụm của phương pháp được thiết lập vào năm 1998 bởi các phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) [3] và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) [4] để xác định độ tái lập. Đối với phép xác định giới hạn lặp lại, có bảy phòng thử nghiệm thực hiện phân tích trên mẫu đậu tương lặp lại hai lần. Đối với phép xác định giới hạn tái lập, bảy phòng thử nghiệm thực hiện các phép phân tích riêng rẽ trên hai mẫu đậu tương và một mẫu hạt đậu tương rang.

Thông số

Mẫu^a

1

2

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm

7

7

7

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi đã loại trừ ngoại lệ

7

7

7

Hoạt độ ức chế trypsin trung bình, mg/g

...

...

...

1,53

2,08

Độ lệch chuẩn lặp lại (s_r), mg/g

0,03

0,06

0,37

Hệ số biến thiên lặp lại, %

2,31

4,18

...

...

...

Giới hạn lặp lại (r) [(r = 2,8 x s_­r], mg/g

0,09

0,18

1,03

Độ lệch chuẩn tái lập (s_R), mg/g

0,75

0,40

0,67

Hệ số biến thiên tái lập, %

...

...

...

25,9

35,7

Giới hạn tái lập (R) [R = 2,8 x s_R], mg/g

2,11

1,11

1,88

^a Mẫu 1 và 2: đậu tương.

Mẫu 3: Hạt đậu tương rang

...

...

...

[1] KAKADE M. L., SIMONS N., LIENER I. E. An Evaluation of Natural vs. synthetic Substrates for Measuring the Antitryptic Activity of Soybean Samples. Cereal Chem., 46, 1969, pp. 518-526.

[2] SMITH C., VAN MEGEN W., TWAALFHOVEN L., HITCHCOCK C. The Determination of Trypsin Inhibitor Levels in Foodstuffs. J. Sci. Food Agric., 31. 1980, pp. 341-350

[3] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[4] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[5] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002), Thức ăn chăn nuôi – Lấy mẫu

[6] TCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998), Thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử.

1) Merck No. 24579 là ví dụ về sản phẩm thích hợp bán sẵn. Thông tin này tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng sản phẩm đó.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9130:2011 (ISO 14902:2011) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hoạt độ chất ức chế trypsin trong các sản phẩm đậu tương