A.2 Môi trường Ashby

Mannitol (Glucoza)

20,0g

K₂HPO₄

0,2 g

MgSO₄.7H₂O

0,2 g

NaCl

0,2 g

...

...

...

0,1 g

CaCO₃

5,0 g

Thạch

20,0 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

6,8 đến 7,0

...

...

...

Axit malic

5,0 g

KH₂PO₄

0,5 g

FeSO₄.7H₂O

0,05 g

MnSO₄.H₂O

0,01 g

MgSO₄.7H₂O

...

...

...

NaCl

0,02 g

CaCl₂

0,01 g

Na₂MoO₄

0,002 g

Dung dịch Bromotymol xanh (5%)

2,0 ml

Hoặc dung dịch công gô đỏ 1%

...

...

...

Thạch

20,0 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

6,8 đến 7,0

CHÚ THÍCH A.3: pH môi trường được điều chỉnh bằng KOH

A.4 Môi trường Pikovskaya

Glucoza

...

...

...

Ca₃(PO₄)₂

5,0 g

(NH₄)₂SO₄

0,5 g

KCl

0,2 g

MgSO₄.7H₂O

0,1 g

MnSO₄

...

...

...

FeSO₄

vết

Cao nấm men

0,5 g

Thạch

20,0 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

...

...

...

A.5 Môi trường SPA (Sucrose Peptone Agar)

Sacaroza

20,0 g

Pepton

5,0 g

K₂HPO₄

0,5 g

MgSO₄.7H₂O

0,25 g

...

...

...

20,0 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

6,8 đến 7,0

A.6 Môi trường Czapek

NaNO₃

3,0 g

Sacaroza

...

...

...

KH₂PO₄

1,0 g

MgSO₄.7H₂O

0,5 g

Thạch

20,0 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

...

...

...

CHÚ THÍCH A.6: pH môi trường được điều chỉnh bằng HCl hoặc NaOH.

A.7 Môi trường Czapek-Dox

NaNO₃

2,0 g

KCl

1,0 g

KH₂PO₄

1,0 g

MgSO₄.7H₂O

...

...

...

FeSO₄

0,01 g

Thạch

20,0 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

6,0 đến 6,5

CHÚ THÍCH A.7: pH môi trường được điều chỉnh bằng HCl hoặc NaOH.

...

...

...

Dextroza

20,0 g

Khoai tây

20,0 g

Thạch

 20,0 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

...

...

...

CHÚ THÍCH A.8:

- khoai tây thái nhỏ, cho vào 1 l nước và đun sôi trong 20 min,

- sau đó lọc lấy nước trong để sử dụng làm môi trường.

A.9 Môi trường Gauze

Tinh bột tan

20,0 g

KNO₃

1,0 g

KH₂PO₄

...

...

...

MgSO₄.7H₂O

0,5 g

NaCl

0,5 g

FeSO₄

0,01 g

Thạch

20,0 g

Nước cất vừa đủ

...

...

...

pH

7,0 đến 7,2

CHÚ THÍCH A.9: pH môi trường được điều chỉnh bằng HCl hoặc NaOH.

A.10 Môi trường ISP- 4 (Inorganic Salts Starch)

Tinh bột tan

10,0 g

KH₂PO₄

1,0 g

MgSO₄.7H₂O

...

...

...

NaCl

1,0 g

(NH₄)₂SO₄

2,0 g

CaCO₃

1,0 g

Thạch

20,0 g

Nước cất vừa đủ

...

...

...

pH

7,0 đến 7,2

CHÚ THÍCH A.10: pH môi trường được điều chỉnh bằng HCl hoặc NaOH.

A.11 Dung dịch pha loãng (dung dịch natri clorua)

Natri clorua (NaCl)

8,5 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

...

...

...

PHỤ LỤC B

(Qui định)

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ VI KHUẨN GÂY BỆNH CÂY TRỒNG CẠN

B.1 Xác định hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng thông qua kích thước vòng đối kháng

B.1.1 Cách tiến hành

Lấy 0,1 ml dung dịch vi khuẩn gây bệnh (mật độ tế bào vi sinh vật đạt 10⁸ CFU/ml) cấy vào đĩa Petri chứa 30 ml môi trường SPA (lớp thạch thứ nhất) đã chuẩn bị sẵn (6.1.2.2).

Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung dịch vi khuẩn gây bệnh thấm hoàn toàn trên bề mặt thạch, đợi khô bề mặt thạch;

Sau khi bề mặt thạch khô (khoảng 4 h), tiếp tục phủ khoảng 15 ml đến 20 ml môi trường thích hợp với vi sinh vật đối kháng (lớp thạch thứ hai) lên lớp thạch thứ nhất. Các đĩa thạch được để khô trong 45 min;

...

...

...

Lấy 0,1 ml dung dịch huyền phù ban đầu (xem 6.2.3.1.a) cấy lên bề mặt lớp thạch thứ hai. Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dịch mẫu thấm hoàn toàn trên bề mặt lớp thạch thứ hai;

Các đĩa thạch được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ từ 28 ^OC đến 32 ^OC trong thời gian từ 3 ngày đến 5 ngày;

Mỗi mẫu được lặp lại không ít hơn 3 lần.

B.1.2 Tính kết quả

Hoạt tính đối kháng của vi sinh vật thể hiện thông qua kích thước vòng đối kháng (vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc), tính bằng mm theo công thức (3):

Kích thước vòng đối kháng = D - d                                                        (3)

trong đó

D là đường kính vòng đối kháng, tính bằng mm;

D là đường kính khuẩn lạc, tính bằng mm.

...

...

...

B.2 Xác định hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng thông qua tỷ lệ cây bị bệnh

B.2.1 Tiến hành thử nghiệm

Thử nghiệm được tiến hành với 2 công thức: Công thức đối chứng (nhiễm vi khuẩn gây bệnh), công thức thí nghiệm (nhiễm vi sinh vật đối kháng và vi khuẩn gây bệnh). Mỗi công thức được lặp lại không ít hơn 3 lần với tổng số cây không ít hơn 50 cây;

Dung dịch vi sinh vật đối kháng được bón vào đất vô trùng trước khi gieo trồng, đảm bảo mật độ vi sinh vật đối kháng đạt 10⁶ CFU/g đất;

Ngâm hạt hoặc củ giống trong dịch vi khuẩn gây bệnh (mật độ đạt 10⁸ CFU/ml) trong thời gian 30 min. Gieo (trồng) hạt (hoặc củ) đã nhiễm vi khuẩn gây bệnh vào đất đối với công thức đối chứng và đất đã được nhiễm dịch vi sinh vật đối kháng đối với công thức thí nghiệm;

Thí nghiệm được chăm sóc theo qui trình phù hợp với từng đối tượng cây chủ; đảm bảo sự phát triển, phát sinh của vi khuẩn gây bệnh; Sử dụng nước vô trùng để giữ ẩm độ tương đối (RH) không nhỏ hơn 70 % và nhiệt độ đạt từ 25 ^oC đến 30 ^oC;

Trong thời gian từ 30 đến 45 ngày kể từ khi gieo trồng, phải quan sát và ghi nhận hàng ngày tình trạng sức khỏe của cây trồng (không có triệu chứng bệnh hoặc có triệu chứng bệnh).

CHÚ THÍCH 4:

1) Đất được khử trùng bằng phương pháp khử trùng ngưng đoạn [khử trùng 3 ngày liên tiếp ở 121 ^OC không ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực (5.2)].

...

...

...

3) Thử nghiệm phải bảo đảm hạn chế tối đa ảnh hưởng của các yếu tố phi thí nghiệm.

B.2.2 Tính kết quả

Tỷ lệ cây bị bệnh (%) được tính theo công thức (4):

Tỷ lệ cây bị bệnh (%) =

Trung bình cộng số cây bị bệnh

x 100                (4)

Trung bình cộng số cây điều tra

So sánh tỷ lệ cây bị bệnh giữa công thức thí nghiệm với công thức đối chứng và đánh giá hoạt tính đối kháng của vi sinh vật theo các cấp độ nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 – Mức độ hoạt tính đối kháng của vi sinh vật

...

...

...

Cấp độ đối kháng

Mức độ hoạt tính đối kháng

1. Không lớn hơn 30

1

Cao

2. Từ 31 đến 50

2

Khá

3. Từ 51 đến 70

...

...

...

Trung bình

4. Từ 71 đến 80

4

Yếu

5. Không nhỏ hơn 80

5

Không có

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8741:2011 về Vi sinh vật nông nghiệp - Phương pháp bảo quản ngắn hạn