Cặp mồi Pf -1/Pr -1 dùng để khuếch đại đoạn DNA của vi khuẩn NHP có kích thước 441 bp.

Chuẩn bị mồi:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µl làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µl: pha loãng mồi gốc bằng nước không có nuclease hoặc đệm TE (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).

3.2.1.5.2.2. Chuẩn bị phản ứng

Tùy theo điều kiện phòng thử nghiệm, chọn lựa hỗn hợp Mix phản ứng cho phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong 1 ống Eppendorf dựa trên tổng số mẫu cần chẩn đoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm. Sau đó hút 22,5µl hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf 0,2 ml; ghi ký hiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, chứng dương và chứng âm.

3.2.1.5.2.3. Tiến hành phản ứng PCR

Thêm 2,5 µl DNA mạch khuôn (tách chiết được) vào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứng PCR (thành phần gồm: Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl₂ 1,5 mM, deoxynucleotide 200 mM, nồng độ 0,5 µM mỗi mồi Pf -1 và Pr -1, nước cho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 µl.

...

...

...

Ví dụ về hỗn hợp phản ứng PCR sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X như trong Bảng 2.

Bảng 2 – Hỗn hợp phản ứng PCR

Thành phần

Thể tích cho 1 mẫu, µl

Nồng độ cuối cùng

Promega Gotag Green Master Mix, 2X

12,5

1 X

Pr -1 mồi

...

...

...

0,5 µM

Pr -1 mồi

0,625 (20 µM)

0,5 µM

DNA mạch khuôn

2,5

Nước

8,75

...

...

...

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Bước

Nhiệt độ/thời gian

Số chu kỳ

Biến tính

94 °C/30 s

35

...

...

...

58 °C/30 s

Kéo dài mạch

72 °C/1 min

Kéo dài mạch

72 °C/5 min

1

Giữ ổn định

4 °C

...

...

...

3.2.1.5.3. Chạy điện di

3.2.1.5.3.1. Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.

Sau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì cho vào 5 µl etidi bromua vào mỗi 100 ml. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để etidi bromua tan đều.

Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch vào khuôn.

Tiến hành đổ vào bản gel, không nên đổ bản gel dày quá 0,8 cm.

Khi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.

Chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel.

3.2.1.5.3.2. Điện di

...

...

...

Khi thực hiện điện di, chạy kèm theo DNA marker để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang DNA vào một giếng trên bản gel.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V đến 150 V (quan sát thấy bóng khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện). Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agarose, dừng quá trình điện di.

CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di nhỏ 2 µl đệm tải mẫu 6X lên giấy parafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra, nhỏ vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10 µl nhỏ vào một giếng trên bản gel.

3.2.1.5.4. Đọc kết quả

Sau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm.

Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang DNA, mẫu đối chứng dương tính và mẫu đối chứng âm tính để đưa ra kết luận.

Bảng 4 – Kết quả điện di

Giếng

Vạch 441 bp

...

...

...

Thang DNA

Phân vạch rõ ràng và sáng theo kích thước sử dụng

Điện di tốt

Mẫu đối chứng dương tính

Có

Hỗn hợp phản ứng PCR tốt

Không

Mẫu đối chứng dương tính hỏng, enzym hỏng

Mẫu đối chứng âm tính

...

...

...

Không ngoại nhiễm

Có

Bị ngoại nhiễm

Mẫu

Có

Dương tính NHP

Không

Âm tính với NHP

Kết quả mẫu thử dương tính khi: Xuất hiện vạch sáng có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 441bp. Thang DNA phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm thanh không có vạch sáng.

...

...

...

3.2.2. Phương pháp mô học

3.2.2.1. Thuốc thử và vật liệu thử

- Dung dịch Davidson (xem A.1).

- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).

- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).

- Xylen.

- Cloroform.

- Axit picric (dung dịch bão hòa).

- Etanol 70 %, 90 % và etanol tuyệt đối.

...

...

...

- Keo dán, ví dụ Bom Canada.

- Dinatri hydro phosphat (Na₂HPO₄);

- Natri Hydro phosphat (NaH₂PO₄);

3.2.2.2. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:

- Kính giải phẫu

- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen

- Lọ nhỏ cố định mẫu

- Bình rót parafin

...

...

...

- Máy cắt mẫu microtome

- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ

- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu

- Kính hiển vi quang học

- Cassete

- Khung đúc mẫu.

3.2.2.3. Lấy mẫu

Thu những mẫu tôm có dấu hiệu không bình thường, cơ thể yếu, bơi lội lờ đờ, biếng ăn và ruột rỗng, giảm sức tăng trưởng rõ rệt, tỷ lệ trọng lượng, chiều dài thân thấp (mỏng đuôi).

Tôm có vỏ mềm và cơ thể nhũn; mang đen hoặc sẫm màu; bị nhiều vi sinh vật cơ hội bám trên mặt vỏ; vỏ bị nhiễm vi khuẩn, bao gồm các tổn thương loét lớp cutin hoặc phần phụ bị ăn mòn hóa đen; bị phồng rộp các tế bào sắc tố dẫn đến sự xuất hiện các rìa sẫm màu ở các náng đuôi và chân bụng. Khối gan tụy có thể bị teo.

...

...

...

3.2.2.4. Cách tiến hành

3.2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu

Cố định trong dung dịch Dadvison. Đối với ấu trùng hoặc tôm Postlarvae có thể cố định cả con trong dung dịch Davidson từ 12 h đến 24 h. Số tôm thu từ 30 con đến 50 con mỗi bể. Sau đó cố định trong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.

Đối với tôm lớn cố định bằng cách lấy tôm sống cắt giữa phần đầu ngực và bụng, giữ phần đầu ngực lại (trong đó có chứa gan tụy), dùng thuốc Davidson tiêm vào gan tụy và vùng xung quanh gan tụy. Lượng thuốc dùng từ 0,1 ml đến 10 ml (thay đổi tùy kích thước tôm), sau đó cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một ao. Nếu mẫu lớn cần phải cắt nhỏ, chiều dài mẫu không quá 3 cm. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10, ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay trong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.

3.2.2.4.2. Khử mẫu cố định

Ngâm trong etanol 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong etanol tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần.

3.2.2.4.3. Làm trong mẫu

Ngâm sang lọ xylen 1, để trong 30 min đến 60 min.

Ngâm sang lọ xylen 2, để trong 30 min đến 60 min.

...

...

...

Đúc khuôn: đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắt được tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.

3.2.2.4.4. Cắt mẫu

Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá.

Đặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước 30 °C đến 35 °C; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô.

3.2.2.4.5. Nhuộm tiêu bản H&E

Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượt trong etanol tuyệt đối, etanol 90 % và etanol 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.

Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ etanol 75 %, etanol 90 % và etanol tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, ví dụ Bom Canada. Để khô và soi kính.

...

...

...

Soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật kính có độ phóng đại cao (100 X, 400 X, 1 000 X).

Mô học gan tụy của tôm bị bệnh hoại tử gan tụy thể hiện đặc điểm bệnh lý sau: Các vùng mô gan tụy bị hoại tử, bắt màu đồng đều của thuốc nhuộm, hoàn toàn không còn nhìn thấy cấu trúc tế bào và mô gan tụy đồng thời xuất hiện dày đặc những tế bào máu bao vây xung quanh những vùng bị hoại tử. Trên lát cắt mô học gan tụy với thuốc nhuộm haematoxylin và eosin cho thấy dấu hiệu của sự viêm teo từ trung bình tới rất nặng của ống gan tụy. Các tế bào biểu mô gan tụy khi bị viêm teo hoại tử chuyển từ hình trụ tròn sang hình khối, hoặc có thể bị phình to và chứa một số lớn vi khuẩn tự do giống với rickettsia, gram âm nằm trong nguyên sinh chất của các tế bào.

Ở tôm P, vannamei giai đoạn ấu niên bị nhiễm bệnh NHP nặng, mãn tính biểu mô tuyến gan tụy bị teo rõ rệt, dẫn đến phù thũng nặng (dịch tràn hoặc các khu vực có nước trong gan tụy).

Độ phóng đại 10000X tôm bị bệnh trong tế bào chất có nhiều vi khuẩn bệnh NHP dạng hình que và hình xoắn.

4. Báo cáo kết quả chẩn đoán

Tôm được xác định nhiễm bệnh NHP khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng của bệnh và dương tính một trong hai phương pháp sau:

- Kết quả phản ứng PCR dương tính;

- Mẫu cắt mô có bệnh tích của NHP.

...

...

...

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THUỐC THỬ

A.1. Dung dịch Davidson

Etanol 95 %:                                                                 330 ml

Formalin (formaldehyd 37 %):                                        220 ml

Axit axetic đậm đặc:                                                      115 ml

Nước:                                                                           335 ml

A.2. Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin – Mayer)

Hematoxylin dạng tinh thể:                                             1 g

...

...

...

Amoni alum [NH₄Al(SO₄)₂] hoặc kali alum [KAl(SO₄)₂]:      50 g

Axit xitric:                                                                     1 g

Cloral hydrat:                                                                50 g

Nước:                                                                           1 000 mg

Hòa tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amomi alum hoặc kali alum, hòa tan, tiếp tục cho axit xitric và cloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.3. Thuốc nhuộm eosin

Eosin Y:                       1 g

Etanol 70 %:                 1 lít

...

...

...

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 %. Hòa tan eosin trong etanol, sau đó cho thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bacterial disease of shrimp C.10 Neccrotising Hepatopancreatitis (NHP). Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases.207 – 10

[2] Boris Brinez, Fernando Aranguren, Marcela Salazar (2003) Fecal samples as a DNA source for the diagnosis of necrotizing hepatopancreatitis (NHP) in Penaeus vannamei broodstock. Dis Aquat Org Vol. 55: 69 – 72

[3] Diseases of crustaceans, Bacterial diseases – Necrotising hepatopancreatitis. Sourced form AGDAFF-NACA (2007). Aquatic Animal Diseases Significant to Asia-Pacific

[4] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội. Bệnh học thủy sản. 2004. 232-235.

[5] Loy JK, Frelier P, Varner P, Templeton JW (1996) Detection of the etiologic agent of necrotizing hepatopancreatitis in cultured Penaeus vannamei from Texas and Peru by polymerase chain reaction. Dis Aquat Org Vol 25:117 – 122

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm