CHÚ THÍCH: (*) sử dụng theo bảng mã IUB;

R là G hoặc A;

H là A hoặc T hoặc C;

N là G hoặc A hoặc T hoặc C;

Y là T hoặc C.

E.2  Thực hiện phản ứng RT- nested PCR

Bước 1: Thực hiện phản ứng RT- PCR sử dụng cặp mồi SVC F1 /SVC R2

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Thành phần cho 1 phản ứng (xem bảng E.2) và chu trình nhiệt (xem Bảng E.3)

...

...

...

Bảng E. 2 - Thành phần của phản ứng RT- PCR và chu trình nhiệt

Thành phần

Nồng độ

Thể tích cho 1 phản ứng (µl)

Nước không có ARN/ ADN

7,5

2X Reaction Mix

...

...

...

Mồi SVC F1

20 µM

0,5

Mồi SVC R2

20 µM

0,5

Enzyme Taq Mix

1,0

...

...

...

22

Chuyển 22 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 3 µl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng SVC chuẩn;

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 3 µl nước tinh khiết không có nuclease;

- Mẫu thử: Cho 3 µl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng;

- Tiến hành phản ứng RT PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng E.3).

Bảng E. 3 - Chu trình nhiệt của phản ứng RT PCR

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

...

...

...

50

30 min

1

94

2 min

94

15 s

40

55

...

...

...

68

1 min

68

5 min

1

Bước 2: Thực hiện phản ứng nested PCR sử dụng cặp mồi SVC F1/ SVC R4:

- Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất;

- Lấy sản phẩm bước 1 để chuẩn bị cho phản ứng bước 2 - Nested PCR;

- Thành phần cho 1 phản ứng (xem bảng E.4) và chu trình nhiệt (xem Bảng E.5).

...

...

...

Bảng E. 4 - Thành phần của phản ứng nested PCR

Thành phần

Nồng độ gốc

Thể tích cho 1 phản ứng (µl)

Nước không có ARN/ADN

9

PCR Master Mix (2X)

...

...

...

SVC F1

20 µM

0,5

SVC R4

20 µM

0,5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

22,5

Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng sau đó cho thêm:

...

...

...

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 µl nước tinh khiết không có nuclease;

- Mẫu thử: Cho 2,5 µl mẫu sản phẩm từ bước 1.

Tiến hành phản ứng nested PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng E.5)

Bảng E.5 - Chu trình nhiệt của phản ứng nested PCR

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Số chu kỳ

95

2 min

...

...

...

95

30 s

30

55

30 s

72

60 s

72

10 m

...

...

...

Giữ ở 4 °C đến khi tắt máy

Phụ lục F

(Quy định)

Phát hiện vi rút gây bệnh xuất huyết mùa xuân bằng phương realtime RT-PCR

F.1  Trình tự đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe) cho phản ứng realtime RT-PCR

Bảng F.1 - Trình tự đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe) cho phản ứng realtime RT-PCR^[10]

Cặp mồi/ Đoạn dò

Tên mồi

...

...

...

Kích thước sản phẩm, bp

Xuôi

SVC-F

TGC TGT GTT GCT TGC ACT TAT YT

81

Ngược

SVC-R

TCA AAC KAA RGA CCG CAT TTC G

Dò

...

...

...

FAM-ATG AAG ARG AGT AAA CKG CCT GCA ACA GA-TAMRA

Thực hiện phản ứng realtime RT-PCR

Phương pháp realtime RT-PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của SVCV, sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (3.2.12) và kít nhân gen (3.2.11) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng F.2) và chu trình nhiệt (xem Bảng F.3)

VÍ DỤ: Superscript III Platinum^® one step qRT-PCR System, Cat.No: 11732-020[4]⁾

Bảng F.2 - Thành phần phản ứng realtime RT PCR

Thành phần

Nồng độ gốc

Thể tích cho 1 phản ứng (µl)

...

...

...

5,5

Dung dịch 2X Reaction Mix

12,5

Mồi SVCV-F

10 µM

0,5

Mồi SVCV-R

...

...

...

0,5

Đoạn dò SVCV-p

5 µM

0,5

Enzyme

0,5

Mẫu RNA

5

...

...

...

25

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 5 µl mẫu RNA đã được giám định hoặc sử dụng các chủng SVC chuẩn.

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

- Mẫu thử: Cho 5 µl mẫu RNA kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng real-time RT-PCR bằng máy nhân gen (4.2.2) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng F.3)

Bảng F.3 - Chu kỳ luân nhiệt đối real-time RT-PCR

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

...

...

...

50

15 min

01

95

2 min

01

95

15 s

40

...

...

...

30 s

(Ghi nhận tín hiệu quang ở bước này)

CHÚ THÍCH BẢNG: (*) Nhiệt độ và thời gian này phù hợp với máy Realtime PCR ABI 7500

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Alikin Y.S., Shchelkunov I.S., Shchelkunova T.I., Kupinskaya O.A., Masycheva V.I., Klimenko V.P. & Fadina VA. 1996. Prophylactic treatment of viral diseases in fish using native RNA linked to soluble and corpuscular carriers. J. Fish Biol., 49, 195-205.

[2] Aquatic Animal Diseases significant to Australia: Identification Field Guide 4th Edition

[3] BÉKÉSI L. & CSONTOS L. (1985). Isolation of spring viraemia of carp virus from asymptomatic broodstock carp, Cyprinus carpio L. J. Fish Dis., 8, 471-472

[4] Bùi Quang Tề và cộng sự. 2008., Bệnh học thủy sản.

...

...

...

[6] OIE - Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals, 2017, chương 2.3.9 - Spring viraemia of carp (SVC).

[7] Stone D.M., AhneW., Denham K.D., Dixon P.F., LIU C.T.Y., Sheppard A.M., Taylor G.R. & Way K. 2003. Nucleotide sequence analysis of the glycoprotein gene of putative spring viraemia of carp virus and pike fry rhabdovirus isolates reveals four genogroups. Dis. Aquat. Org., 53, 203-210.

[8] TCVN 8710 -7: 2012 Quy trình chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép.

[9] TCVN 1-2: 2008 Xây dựng tiêu chuẩn - Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.

[10] ZhlqinYue và cs, 2008. Development of a sensitive and quantitative assay for spring viremia of carp virus based on real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods.

[1]⁾ Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[2]⁾ Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[3]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[4]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép