A.2  Cách chuẩn bị

Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình chiết tách ADN/ARN

Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp. Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 thì các bước được thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

...

...

...

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

B.2  Tiến hành chiết tách mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF

- Hút 200 μl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

- Giải đông, vortex huyễn dịch 10 % mẫu đã chuẩn bị ở mục 7.1.2. Sau đó tiến hành ly tâm 2500 g trong 15 phút. Hút 200 μl dịch trong bên trên vào ống Lysis buffer và trộn đều.

- Ly tâm lắng (5.2.4) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.3) và sắp xếp thứ tự trên khay.

...

...

...

- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 μl dung dịch Elution Buffer.

- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 μl dung dịch hạt từ.

- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

- Hút toàn bộ dung dịch trong giếng đĩa thu ADN/ARN cho vào ống thu hồi 500 μl vô trùng đã ghi sẵn ký hiệu mẫu chiết tách tương ứng.

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.

Phụ lục C

...

...

...

Phát hiện vi rút KHV bằng phương pháp PCR

C.1  Trình tự mồi

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát hiện gen của vi rút KHV theo Bercovier TK (OIE, 2017)

Bảng C.1 - Trình tự mồi

Mồi

Trình tự (5' - 3')

Kích thước sản phẩm

bp

Mồi xuôi

...

...

...

409

Mồi ngược

CAC-CCA-GTA-GAT-TAT-GC

C.2  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt

- Pha hỗn hợp nhân gen (master mix) theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kít nhân gen PCR. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix HotstarTaq^®Master Mix, Catalogue Number: 203445 của hãng Qiagen (thành phần bao gồm: HotStarTaq ADN Polymerase, PCR Buffer (với 3 mM MgCl₂) và 400 μM dNTP).

- Tổng thể tích của phản ứng PCR là 25 μl (20 μl hỗn hợp Master mix và 5 μl mẫu ADN):

+ Cho 20 μl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.

+ Cho 5 μl ADN vừa tách chiết vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

...

...

...

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl ADN dương chuẩn của vi rút KHV (mẫu ADN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi rút KHV) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (hỗn hợp Master mix và mẫu ADN) vào máy PCR và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR.

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng PCR

Thành phần

Nồng độ

μM

Thể tích cho 01 phản ứng

μl

Nước không có DNAse/RNAse

...

...

...

6,5

Mồi xuôi

10

0,5

Mồi ngược

10

0,5

Dung dịch HotStarTaq Master Mix

...

...

...

Mẫu đã chiết tách (ADN)

5

Tổng thể tích

25

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt

Nhiệt độ

°C

Thời gian

...

...

...

95 (*)

15 phút (*)

01

94

30 giây

55

30 giây

35

...

...

...

30 giây

72

7 phút

01

Giữ ở 4 °C

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít HotstarTag^®Master Mix, Cat. No.: 203445 (Qiagen).

C.3  Điện di sản phẩm PCR

- Chuẩn bị thạch Agarose (3.2.4) 1,5 % pha trong dung dịch TBE (3.2.4) 0,5X bổ sung chất nhuộm gel (3.2.5) (ví dụ như: gel red) với tỷ lệ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

- Thạch khô, rút lược ra và cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X.

- Cho mẫu vào các giếng (10 μl sản phẩm PCR + 2 μl dung dịch dung dịch nạp mẫu (3.2.6)).

- Sử dụng thang chuẩn ADN (100 bp) (3.2.7).

LƯU Ý: Khi chạy điện di sản phẩm PCR phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm.

- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V - 100 V.

- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp, chụp ảnh.

Phụ lục D

(Tham khảo)

...

...

...

D.1  Trình tự cặp mồi, đoạn dò

Bảng D.1 - Trình tự cặp mồi, đoạn dò

Mồi và đoạn dò

Trình tự (5' - 3')

Kích thước sản phẩm khuếch đại

bp

Mồi xuôi: KHV 86f

GAC-GCC-GGA-GAC-CTT-GTG

78

...

...

...

CGG-GTT-CTT-ATT-TTT-GTC-CTT-GTT

Đoạn dò: KHV-109p

6FAM CTT-CCT-CTG-CTC-GGC-GAG-CAC-G TAMRA

D.2  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt

- Sử dụng cặp mồi, đoạn dò đã chuẩn bị và bộ kít thương mại theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix Platinum^® Quantitative PCR SuperMix - UDG, Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen (thành phần bao gồm: Taq ADN polymerase, Tris-HCl, KCl, 6 mM MgCl₂,400 μM dGTP, 400 μM dATP, 400 μM dCTP, 800 μM dUTP, uracil ADN glycosylase (UDG)).

- Pha hỗn hợp nhân gen (Master mix) theo hướng dẫn của bộ kít.

- Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp Master mix tiến hành:

+ Cho 20 μl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml;

+ Cho 5 μl ADN vừa tách chiết vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix;

...

...

...

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có DNAse/RNAse vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl ADN dương chuẩn của vi rút KHV (mẫu ADN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi rút KHV) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (20 μl hỗn hợp Master mix và 5 μl) vào máy realtime PCR và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng realtime PCR.

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng realtime PCR

Thành phần nguyên liệu

Nồng độ

μM

Thể tích cho 01 phản ứng

μl

...

...

...

6,0

Mồi xuôi: KHV-86f

20

0,5

Mồi ngược: KHV-163R

20

0,5

Đoạn dò: KHV-109p

...

...

...

0,5

Dung dịch SuperMix

12,5

Mẫu đã chiết tách (ADN)

5

Tổng thể tích

25

...

...

...

Nhiệt độ

°C

Thời gian

Số chu kỳ

50 (*)

2 phút (*)

1

95 (*)

2 phút (*)

...

...

...

95

15 giây

45

58

40 giây

(Ghi nhận tín hiệu quang)

72

10 giây

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít PlatinumQuantitative PCR SuperMix-UDG, Cat. No.: 11730-017.

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 8710-6: 2012: Bệnh Thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 6: Bệnh do Koi Herpesvirus ở cá chép.

[2] RAHO6_V615-32: 2017. Quy trình phát hiện Koi Herpesvirus (KHV) bằng kỹ thuật Realtime PCR.

[3] OIE (Office International des Epizooties), 2017. Koi Herpesvirus Disease. Chapter 2.3.7. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals.

[4] Oren Gilad, Susan Yun, Francisco J. Zagmutt-Vergara, Christian M. Leutenegger, Herve Bercovier, Ronald P. Hedrick, 2004. Concentrations of a Koi herpesvirus (KHV) in tissues of experimentally infected Cyprinus carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR. Diseases of aquatic organisms. 60: 179-187.

1) ^{và 2)} Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-6:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép