Tổng: 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2  Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hoà chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.2.1  Thành phần

Natri clorua (NaCl)

8 g

Natri hydro photphat dihydrat (Na₂HPO₄.2H₂O)

...

...

...

Kali dihydro photphat (KH₂PO₄)

0,2 g

Kali clorua (KCl)

0,2 g

Nước cất

1000 ml

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên vào 1000 ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Chỉnh pH về trung tính bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min.

...

...

...

Ethanol 95 %:

330 ml

Formalin (formaldehyd 37 %):

220 ml

Axit axetic đậm đặc:

115 ml

Nước:

335 ml

A.4  Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin - Mayer)

...

...

...

1 g

Natri iodat:

0,2 g

Amoni alum [NH₄Al(SO₄)₂] hoặc kali alum [KAl(SO₄)₂]: 50 g Axit xitric:

1 g

Cloral hydrat:

50 g

Nước:

1000 ml

...

...

...

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.5  Thuốc nhuộm eosin

Eosin Y:

1 g

Ethanol 70 %:

1000 ml

Axit axetic:

5 ml

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào ethanol 70 %. Hoà tan eosin trong ethanol, sau đó cho thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

...

...

...

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ARN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

B1. Tách chiết ARN bằng bộ kít InviMAG^®Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96

B1.1. Chuẩn bị hóa chất

Các hóa chất cần được chuẩn bị và bảo quản theo đúng hướng dẫn của bộ kít InviMAG^®Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat. No: 7441050100, với thể tích vừa đủ cho số lượng mẫu chiết tách, bao gồm:

(1) Dung dịch đệm Lysis Buffer RV

...

...

...

(3) Dung dịch rửa 2 (Wash 2)

(4) Hỗn hợp hạt từ tính (Bead Mix)

(5) Dung dịch thu hồi DNA/RNA Elution Buffer (EB)

Nếu chiết tách RNA bằng máy chiết tách tự động Thermo Scientific™ KingFisher™ Flex, cần phải chuẩn bị trước các đĩa chứa dung dịch chiết tách theo hệ thống của máy như sau:

+ Đĩa Washing 1: 800μl dung dịch Wash 1/giếng;

+ Đĩa Washing Wash 2 và Washing Wash 3: 800μl dung dịch Wash 2/giếng;

+ Đĩa Elution Buffer: 100 μl dung dịch EB/giếng.

B1.2. Tiến hành

- Huyễn dịch 10% của mẫu bệnh phẩm được rã đông, trộn đều bằng máy vortex. Ly tâm mẫu trong máy ly tâm lạnh với lực ly tâm 2500 vòng/15 min.

...

...

...

- Chuyển toàn bộ dung dịch trong ống eppendorf vào đĩa chứa mẫu 96 giếng (mỗi giếng tương ứng với một mẫu chiết tách). Dùng giấy dán đĩa chuyên dụng dán kín mặt đĩa.

- Đặt đĩa lên máy lắc, ủ nhiệt (HLC-MHR23). Lắc đĩa 15 min, nhiệt độ 65°C.

- Lấy đĩa ra khỏi máy lắc, để nguội trong 5 min, tháo bỏ giấy dán đĩa. Bổ sung 420 μl dung dịch Bead Mix (gồm có 400 μl Binding solution và 20 μl MAP) vào mỗi giếng.

- Chuyển tất cả các đĩa bao gồm: đĩa Tip Combs, đĩa Elution Buffer, đĩa Washing Wash 3, đĩa Washing Wash 2, đĩa Washing Wash 1 và đĩa chứa mẫu vào từng khay của máy chiết tách tự động theo hướng dẫn của máy.

- Chọn chương trình chiết tách RNA đã được cài đặt trước đó theo hướng dẫn của hãng sản xuất kít InviMAG^®Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96.

- Sau 34 min, quá trình chiết tách hoàn tất. Thu hồi RNA của từng giếng vào ống eppendorf 0.5 ml tương ứng đã ghi rõ ký hiệu mẫu.

- Bảo quản mẫu RNA ở 4°C trong vài giờ và âm 20 °C đến âm 80 °C trong thời gian lâu hơn.

B.2. Tách chiết ARN bằng TACO RNA/DNA extraction Kít

B.2.1  Vật liệu: Bộ kít chiết tách TACO RNA/DNA extraction Kít (GeneReach Cat. No. atc-d/rna, 320 tests)

...

...

...

B.2.2  Chuẩn bị:

- Pha dung dịch đệm rửa A (washing buffer A) với 135 ml ethanol tuyệt đối

- Pha dung dịch đệm rửa B (washing buffer B) với 230 ml ethanol tuyệt đối

- Tiến hành theo sơ đồ

Thuốc Thử

Lượng (μl)

Thuốc thử

Lượng (μl)

...

...

...

G

F

E

D

C

B

A

Ethanol tuyệt đối

250

...

...

...

-

►1

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

750

Hạt từ

50

►2

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

750

-

-

►3

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

750

-

...

...

...

►4

...

...

...

750

-

-

►5

...

...

...

Nước đệm

100

-

-

►6

...

...

...

Ethanol tuyệt đối

250

-

-

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

...

...

...

Hạt từ

50

►8

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

750

-

-

►9

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

750

-

-

►10

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

750

...

...

...

-

►11

...

...

...

Nước đệm

100

-

-

►12

...

...

...

B.2.3  Chuẩn bị mẫu:

- Cho 250 μL/mẫu dung dịch đệm vào các ống eppendort.

- Cho 100 μL/mẫu vào ống eppendort chứa dung đệm.

- Lắc bằng máy lắc trộn vortex (4.2.4) trong 15 s.

- Ly tâm 10000 vòng trong 1 min.

- Cho 350 μL (mẫu và dung dịch đệm) vào các giếng ở cột 1 hoặc 7.

...

...

...

- Đặt đĩa vào máy TACO

- Đặt lược vào máy TACO.

- Sử dụng máy TACO theo hướng dẫn sử dụng: Máy TACO tự động chiết tách trong khoảng 50 min.

- Thu 100 μL ARN từ các giếng trong cột 6 hoặc 12 sang các ống eppendort mới.

CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện vi rút gây hội chứng Taura ở tôm

B.3. Tách chiết RNA bằng bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit

B.3.1. Chuẩn bị hóa chất

Các hóa chất cần được chuẩn bị và bảo quản theo đúng hướng dẫn của bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit, Cat. No: 12280-050, với thể tích vừa đủ cho số lượng mẫu chiết tách, bao gồm:

- Proteinase K

...

...

...

- Dung dịch Carrier RNA

- Dung dịch Wash buffer (W5)

- Nước RNase-free (E3)

- Cách pha hỗn hợp dung dịch Carrier và Lysis Buffer

N x 0.21 mL = A mL

A mL x 28 μL/mL = B μL

Trong đó: N là số mẫu cần tách chiết

A là tổng số mL Lysis Buffer cần cho N mẫu;

B là tổng số μL Carrier RNA cần cho N mẫu.

...

...

...

1. Cho 25 μL Proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml;

2. Cho 200 μL mẫu vào ống eppendorf chứa Proteinase K;

CHÚ Ý: nếu thể tích mẫu <200 μL thì có thể điều chỉnh thể tích mẫu cho đủ 200 μL bằng dung dịch PBS hoặc 0.9% NaCl.

3. Cho hỗn hợp dung dịch Lysis Buffer và Carrier RNA vào ống chứa mẫu; đóng nắp ống và vortex 15s;

4. Ủ mẫu ở 56 °C trong 15 min;

5. Cho thêm 250 μL ethanol từ 96 % đến ethanol tuyệt đối vào ống mẫu; đóng nắp và vortex 15s;

6. Để ở nhiệt độ phòng 5 min;

CHÚ Ý: mẫu mô sau khi để ở nhiệt độ phòng 5 min thì đem ly tâm 12.000 vòng trong 2 min và lấy dịch nổi bên trên.

7. Chuyển toàn bộ mẫu tách chiết vào cột lọc;

...

...

...

9. Cho 500 μL nước rửa Wash buffer (W5) vào cột lọc; ly tâm 12.000 vòng trong từ 2 min đến 3 min; Chuyển cột lọc sang ống thu mới;

10. Lặp lại bước 9 với 500 μL nước rửa Wash buffer (W5) một lần nữa;

11. Loại bỏ ống thu và chuyển cột lọc sang ống thu mới;

12. Ly tâm khô 12000 vòng trong 1 min cho khô sạch nước rửa W5;

13. Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 μL;

14. Cho 10 μL - 50 μL nước RNase-free (E3) (có sẵn) vào cột lọc;

15. Để ở nhiệt độ phòng 1 min; Ly tâm cột lọc ở 12000 vòng trong từ 1 min đến 2 min.

16. Lấy sản phẩm dưới cột lọc; Bảo quản mẫu RNA ở 4 °C trong vài giờ và âm 20 °C đến âm 80 °C trong thời gian lâu hơn.

...

...

...

(Quy định)

Phương pháp RT - PCR phát hiện vi rút gây hội chứng Taura ở tôm

C.1  Trình tự cặp mồi

Bảng C.1 - Trình tự cặp mồi^[1]

Cặp mồi

Trình tự mồi từ đầu 5’ tới 3’

Sản phẩm (bp)

9992F

5’-AAG-TAG-ACA-GCC-GCG-CTT-3’

...

...

...

9195R

5’-TCA-ATG-AGA-GCT-TGG-TCC-3’

7171F

5’-CGA-CAG-TTG-GAC-ATC-TAG-TG-3’

341

7511R

5’-GAG-CTT-CAG-ACT-GCA-ACT-TC-3’

C.2  Thực hiện phản ứng RT - PCR

Kỹ thuật RT - PCR bao gồm:

...

...

...

VÍ DỤ: Chuẩn bị MasterMix cho phản ứng RT - PCR theo kít Superscript^® III One-Step RT-PCR with Platinum^® Taq. Cat: 12574-026 hoặc kít tương đương; và hướng dẫn của nhả sản xuất (3.2.3)3)

Thành phần cho 1 phản ứng (xem bảng C.2).

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng RT - PCR với cặp mồi 9992F/ 9195R

Thành phần

Nồng độ (μM)

Thể tích cho 1 phản ứng (μl)

Nước không có ARN/DNA

6

...

...

...

12,5

Mồi 9992F

20

0,5

Mồi 9195R

20

0,5

Enzym

...

...

...

0,5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

20

Bảng C.3 - Thành phần phản ứng RT - PCR với cặp mồi 7171F/7511R

Thành phần

Nồng độ (μM)

Thể tích cho 1 phản ứng (μl)

Nước không có ARN/DNA

...

...

...

Dung dịch 2x Reaction Mix

12,5

Mồi 7171F

20

0,5

Mồi 7511R

20

0,5

...

...

...

0,5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

20

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng chuẩn.

Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 5 μl mẫu kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng RT - PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.4).

...

...

...

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Số chu kỳ (vòng)

50

25 min

1

94

2 min

1

...

...

...

15 s

35

55

30 s

68

60 s

68

5 min

1

...

...

...

+ Phản ứng RT - PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen) và mẫu kiểm chứng âm (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen);

+ Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng RT - PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng;

+ Tùy theo kít sử dụng mà thành phần hỗn hợp phản ứng có thể khác nhau, việc thực hiện chuẩn bị hỗn hợp phản ứng nên tuân thủ theo hướng dẫn của kít được sử dụng.

Phụ lục D

(Quy định)

Phương pháp realtime RT - PCR phát hiện vi rút gây hội chứng Taura ở tôm

D.1  Trình tự cặp mồi và đoạn dò

Bảng D.1 - Trình tự cặp mồi và đoạn dò^[1]

...

...

...

Trình tự mồi từ đầu 5’ tới 3’

TSV1004F

5’-TTG GGC ACC AAA CGA CAT T-3’

TSV1075R

5’-GGG AGC TTA AAC TGG ACA CAC TGT- 3’

TSV-P1

5’-6FAM CAG CAC TGA CGC ACA ATA TTC GAG CAT C BHQ1-3’

D.2  Thực hiện phản ứng realtime RT- PCR

Phương pháp realtime RT - PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của TSV, sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng D.2).

Bảng D. 2 - Thành phần phản ứng realtime RT- PCR

Thành phần

Nồng độ gốc (μM)

Thể tích phản ứng (μl)

Nước không có ARN/DNA

5,5

Dung dịch 2X reaction mix

...

...

...

12,5

Mồi TSV1004F

15

0,5

Mồi TSV1075R

15

0,5

Đoạn dò TSV-P

5

...

...

...

Enzyme Taq Mix

0,5

Tổng thể tích

20

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ARN được tách chiết từ mẫu dương tính chuẩn với TSV;

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease;

- Mẫu thử: Cho 5 μl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

...

...

...

Bảng D. 3 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime RT- PCR

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Số chu kỳ (vòng)

50

15 min

1

95

2 min

...

...

...

95

15 s

40

60 (*)

30 s

CHÚ THÍCH BẢNG: (*) Nhiệt độ và thời gian này phù hợp với máy realtime PCR ABI 7500 và bộ kít ở trên

CHÚ Ý:

+ Phản ứng Realtime RT - PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen) và mẫu kiểm chứng âm (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen);

+ Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng Realtime RT - PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng;

...

...

...

Phụ lục E

(Quy định)

Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

E.1  Xử lý mẫu

Chuyển khuôn chứa mẫu sang ngâm ethanol 70 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 30 min đến 60 min;

Ngâm sang ethanol 90 % (3.1.1) trong thời gian từ 30 min đến 60 min;

Ngâm sang ethanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 min đến 60 min;

Ngâm sang ethanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ hai trong thời gian từ 30 min đến 60 min;

...

...

...

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ hai trong thời gian từ 30 min đến 90 min;

Ngâm tẩm parafin (3.3.5) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 min đến 90 min;

Ngâm tẩm parafin (3.3.5) lần thứ hai, thời gian 120 min;

CHÚ THÍCH: Tất cả các thao tác trên có thể được thực hiện trong máy xử lý mẫu mô tự động (4.2.2).

Đúc khuôn:

Sau đó, đưa mẫu vào khung đúc parafin: rót parafin nóng chảy từ nồi đun parafin (4.3.3) vào khay sắt (4.3.4) chuyên dụng;

Gắp bệnh phẩm vào rồi đặt khuôn nhựa (4.3.1) lên trên;

Để nguội, tách lấy khối parafin.

E.2  Cắt tiêu bản

...

...

...

Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.3.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các tổ chức;

Cắt lấy tiêu bản, độ dày lát cắt từ 3 μm đến 5 μm;

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng và lấy được hết các mô cần lấy, thả vào nồi dãn tiêu bản (4.3.7) có nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C;

Dùng lam kính (4.3.10) vớt dán lát cắt, chuyển sang máy sấy mẫu (4.3.13) có nhiệt độ 40 °C trong 2 h đến 3 h.

E.3  Nhuộm tiêu bản Haematoxylin và Eosin

Tẩy parafin trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong ethanol tuyệt đối (3.1.1) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong ethanol 90 % (3.1.1) để từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong ethanol 70 % (3.1.1) để từ 3 min đến 5 min;

...

...

...

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin (3.3.3) từ 3 min đến 5 min;

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong thuốc nhuộm từ Eosin (3.3.4) từ 3 min đến 5 min;

Loại bỏ nước còn bám trên phiến kính bằng cách:

Nhúng qua ethanol 70 % (3.1.1) để từ 2 min đến 3 min; sau đó nhúng qua ethanol tuyệt đối (3.1.1) 3 lần (3 cốc), mỗi lần để từ 2 min đến 3 min; chuyển sang ngâm trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần từ 2 min đến 3 min; Lau sạch xung quanh và gắn lamen (4.3.9) bằng keo dán (4.3.11).

Để khô tự nhiên và soi dưới kính hiển vi quang học (4.3.8).

Phụ lục F

(Quy định)

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE/WOAH, Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 2021, Chapter 2.2.7 Infection with Taura syndrome virus;

[2] Tang K. F. J., Wang J. and Lightner D. V., 2004. Quantitation of Taura syndrome virus by realtime RT-PCR with a TaqMan assay. J. Virol. Methods 115: 109-114;

[3] FAO/NACA. 2001. Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases. FAO Fish. Pap. No.402/2;

[4] TCVN 8710-5:2011 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán bệnh Taura ở tôm He;

[5] TCVN 8376:2010 Tôm và sản phẩm tôm - Phát hiện virut gây hội chứng taura (TSV) bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp-phiên mã ngược (RT-PCR);

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2) Thông tin này đưa ra tạo đều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

...

...

...

4) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-5:2023 về Bệnh thuỷ sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 5: Hội chứng Taura ở tôm