C.2  Thực hiện phản ứng RT - PCR

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng C.2).

VÍ DỤ: RT-PCR dùng kít nhân gen SuperScript^® III One-Step RT-PCR with Platinum^®Taq.Cat: 12574-026 [3]⁾

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng RT - PCR

Thành phần

Nồng độ (µM)

Thể tích cho 1 phản ứng (µl)

Nước không có ARN/ ADN

...

...

...

7,5

Dung dịch Master Mix

12,5

Mồi 10F

10

0,5

Mồi 144R

10

...

...

...

Enzyme

1

Tổng thể tích

22

Chuyển 22,0 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu đối chứng dương: Cho 3 µl mẫu ARN tách chiết đã được giám định hoặc sử dụng các mẫu chuẩn;

- Mẫu đối chứng âm: Cho 3 µl nước tinh khiết không có nuclease;

- Mẫu thử: Cho 3µl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

...

...

...

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng RT PCR

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Chu kỳ

50

30 min

1

94

2 min

...

...

...

15 s

40

58

30 s

68

1 min

68

5 min

1

...

...

...

Phụ lục D

(Quy định)

Phương pháp realtime RT - PCR phát hiện YHV1

D.1  Trình tự cặp mồi và đoạn dò

Bảng D.1- Trình tự cặp mồi và đoạn dò^[3]

Tên mồi và đoạn dò

Trình tự

Kích thước sản phẩm, bp

YHV 141F

...

...

...

66

YHV 206R

5’-CCA GTG ACG TTC GAT GCA ATA-3’

YHV p

Texas Red CCA TCA AAG CTC TCA ACG CCG TCA BHQ2-3’

D.2  Thực hiện phản ứng Realtime RT- PCR

Phương pháp Realtime RT-PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của YHV1, sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (3.2.2) và kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: theo kít SuperScript III Platinum^® one step qRT-PCR System, Cat.No: 11732-020[4]⁾

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng D.2).

...

...

...

Thành phần

Nồng độ gốc (µM)

Thể tích phản ứng (µl)

Nước không có ARN/DNA

5,5

Dung dịch 2X reaction mix

12,5

...

...

...

20

0,5

Mồi YHV 206R

20

0,5

Đoạn dò YHV-P

6

0,5

Enzyme Taq Mix

...

...

...

0,5

Tổng thể tích

20

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl mẫu ARN được tách chiết từ mẫu dương tính chuẩn với YHV1;

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease;

- Mẫu thử: Cho 5 pl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng realtime PCR bằng máy nhân gen (4.1.2) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng D.3).

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime - PCR

...

...

...

Thời gian

Số chu kỳ

50

15 min

1

95

2 min

1

95

...

...

...

40

60 (*)

30 s

CHÚ THÍCH BẢNG: (*) Nhiệt độ và thời gian này phù hợp với máy Realtime PCR ABI 7500

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] FAO/NACA. 2001. Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases. FAO Fish. Pap. No.402/2:

[2] OIE 2017 Chapter 2. 2. 9- Infection with yellow head virus genotype 1

[3] Tang K.F.J. and Lightner D.V., 2001. Development of real-time PCR assays for detection of White spot syndrome virus, Yellow head virus, Taura syndrome virus and Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp.

...

...

...

[5] TCVN 8710-4-2011 Quy trình chẩn đoán bệnh đầu vàng (YHV) ở tôm.

[6] TCVN 1-2: 2008 Xây dựng tiêu chuẩn - Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.

[1]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[2]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[3]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[4]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-4:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm