B.2.3  Chuẩn bị mẫu:

- Cho 250 µL dung dịch đệm vào các ống Eppendort.

- Cho 100 µL/mẫu vào ống eppendort chứa dung đệm.

- Lắc bằng máy votex (4.1.4) trong 15 giây.

- Ly tâm 12000rpm trong 1 phút.

- Cho 350 µL (mẫu và dung dịch đệm) vào các giếng ở cột 1 hoặc 7.

B.2.4  Đưa mẫu vào máy TACO

- Đặt đĩa vào máy TACO

- Đặt lược vào máy TACO.

...

...

...

- Thu 100µL ADN/RNA từ các giếng trong cột 6 hoặc 12 sang các ống eppendort mới.

CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện vi rút đốm trắng.

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp Nested PCR phát hiện WSSV

C.1  Trình tự cặp mồi

Bảng C.1 - Trình tự cặp mồi^[8]

Tên mồi

...

...

...

Kích thước sản phẩm, bp

146F1

5’-ACT-ACT-AAC-TTC-AGC-CTA-TCTAG-3’

1447

146R1

5’-TAA-TGC-GGG-TGT-AAT-GTT-CTT-ACG-A-3’

146F2

5’-GTA-ACT-GCC-CCT-TCC-ATC-TCC-A-3’

941

...

...

...

5’-TAC-GGC-AGC-TGC-TGC-ACC-TTG-T-3’

C.2  Thực hiện phản ứng Nested PCR

Kỹ thuật nested PCR bao gồm 2 giai đoạn (hoặc 2 bước):

Giai đoạn 1 (bước 1): Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi 146F1/146R1 đã được chuẩn bị và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng bước 1 (xem Bảng C.2).

VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen PCR Master mix của Thermo, Cat.No: #k0171.[5]⁾

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng PCR

Thành phần

Nồng độ,

...

...

...

Thể tích cho 1 phản ứng, µl

Nước không có RNA/ADN

8,0

Dung dịch Master Mix

12,5

Mồi 146F1

20

...

...

...

Mồi 146R1

20

1

Tổng thể tích

22,5

Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 2,5 µl mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng WSSV chuẩn.

Mẫu đối chứng âm: Cho 2,5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 2,5 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

...

...

...

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Nhiệt độ, °C

Thời gian

Số chu kỳ

94

4 min

1

55

1 min

...

...

...

72

2 min

1

94

30 s

39

55

30 s

72

...

...

...

72

5 min

1

Giai đoạn 2 (bước 2): Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi 146F2/146R2 đã được chuẩn bị và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng bước 2 (xem Bảng C.4).

VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen PCR Master mix của Thermo, Cat.No: #k0171.[6]⁾

Bảng C.4 - Thành phần phản ứng Nested PCR

Thành phần

Nồng độ,

...

...

...

Thể tích cho 1 phản ứng, µl

Nước không có RNA/ADN

8,0

Dung dịch Master Mix

12,5

Mồi 146F2

20

...

...

...

Mồi 146R2

20

1

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

22,5

Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu đối chứng dương: chuyển 2,5 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới

- Mẫu đối chứng âm: chuyển 2,5 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới

- Mẫu thử: chuyển 2,5 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới

...

...

...

Bảng C.5 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR bước 2

Nhiệt độ, °C

Thời gian

Số chu kỳ

94

4 min

1

55

1 min

...

...

...

72

2 min

1

94

30 s

39

55

30 s

72

...

...

...

72

5 min

1

Kết thúc chu trình nhiệt của phản ứng Nested PCR tiến hành điện di theo (6.1.4.4)

Phụ lục D

(Quy định)

Phương pháp Realtime PCR phát hiện WSSV

D.1  Trình tự cặp mồi

...

...

...

Tên mồi và đoạn dò

Trình tự

Kích thước sản phẩm, bp

WSSV1011F

5’- Tgg TCC CgT CCT CAT CTC Ag -3 ’

69

WSSV1079R

5'- gCT gCC TTg CCg gAA ATT A -3 ’

WSSV-P

...

...

...

D.2  Thực hiện phản ứng Realtime PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi đặc hiệu WSSV1011F /WSSV1079R và đoạn dò WSSV-p (3.2.2), sử dụng kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen của Platinum® Quantitative PCR SuperMix-UDG, Cat.No: 11730-017[7]⁾.

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng D.2).

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng realtime PCR

Thành phần

Nồng độ

(µM)

Thể tích cho 1 phản ứng

...

...

...

Nước không có RNA/ADN

6,0

Dung dịch 2X reaction mix

12,5

Mồi WSSV1011F

20

0,5

...

...

...

20

0,5

Đoạn dò WSSV-p

6

0,5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

20

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng WSSV chuẩn.

...

...

...

Mẫu thử: Cho 5 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.2) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng D.3).

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR

Nhiệt độ, °C

Thời gian

Số chu kỳ

50

02 min

01

...

...

...

02 min

01

95

15 s

40

60(*)

60 s

Giữ ở 4 °C đến khi tắt máy

CHÚ THÍCH BẢNG: (*) Nhiệt độ và thời gian này phù hợp với máy Realtime PCR ABI 7500

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Bùi Quang Tề. 2008, Bệnh truyền nhiễm của động vật thủy sản.p.122-128.

[2] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội. 2004. Bệnh truyền nhiễm của động vật thủy sản.P. 184-189.

[3] FAO/NACA. 2001. Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases. FAO Fish. Pap. No.402/2: p. 237 pp.

[4] Flegel, T.W. 1997. Special topic review: major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus monodon) in Thailand. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 13 : p. 442.

[5] Hameed, AS., Balasubramanian. G., Musthaq, S.S., Yoganandhan. K. 2003. Experimental infection of twenty species of Indian marine crabs with white spot syndrome virus (WSSV). 57: p. 157-161.

[6] Lightner, D.V. 1996. A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp. Baton Rouge, Louisiana, USA: World Aquaculture Society.

[7] Li, Q., Zhange, Z., Chen, Y., Yang, F. 2003. White spot syndrome virus (WSSV) infectivity for Artemia at different developmental stages. Disease of Aquatic Organism. 57: p. 261-264.

[8] Oie. 2017. Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animails.Chapter 2.2.8.

...

...

...

[10] TCVN 1-2: 2008 Xây dựng tiêu chuẩn - Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.

[11] TCCS 01:2014/TY-TS Quy trình xét nghiệm phát hiện vi rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm bằng kỹ thuật realtime PCR.

[12] TCCS 01:2018/TY-TS Quy trình xét nghiệm phát hiện vi rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm bằng kỹ thuật realtime PCR.

[1]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[2]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[3]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[4]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương

[5]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[6] Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm