6.2.2  Phương pháp realtime PCR

6.2.2.1  Nguyên tắc

Phương pháp phân tích này dựa vào sự khuếch đại đoạn ADN đích của vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây bệnh ở cá được phát hiện thông qua kỹ thuật Realtime PCR, với ADN được tách chiết từ canh thang hoặc từ mẫu bệnh phẩm nhằm rút ngắn tối đa thời gian xét nghiệm.

Nguyên lý của phản ứng SYBR Green realtime PCR là SYBR Green gắn không đặc hiệu với sản phẩm ADN và tín hiệu huỳnh quang tăng tỉ lệ thuận với sản phẩm ADN khi được nhân lên. Chính vì không đặc hiệu nên phương pháp này phải làm thêm bước điện di xác định kích thước vạch sáng của gen đích.

6.2.2.2  Tăng sinh vi khuẩn

Mẫu sau khi xử lý được tăng sinh trong canh thang BHI (xem 3.1.4) theo tỷ lệ 1:10, ủ tăng sinh ở 28 °C đến 30 °C trong tủ ấm (xem 4.1.3) từ 18 giờ đến 24 giờ.

6.2.2.3  Tách chiết ADN

Mẫu sau khi tăng sinh (xem 6.2.2.2) được dùng để chiết tách ADN. Tiến hành tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt (xem Phụ lục C) hoặc dùng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Sau khi chiết tách, ADN được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản ở âm 20 °C hoặc âm 80 °C (xem 5.1.1).

...

...

...

Các bước tiến hành phản ứng tham khảo phụ lục D.

Phương pháp Realtime PCR phát hiện vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây bệnh ở cá sử dụng đoạn mồi IGS. Chuẩn bị mồi ở nồng độ 10 μl với nước sạch DNase/Rnase (3.2.5)

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng realtime PCR phát hiện vi khuẩn Streptococcus agalactiae theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng (tham khảo phụ lục D)

LƯU Ý: Mẫu ADN và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.2.2.5  Điện di1) và đọc kết quả

Các bước tiến hành phản ứng tham khảo phụ lục D, D.3

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel theo bảng 2:

Bảng 2 - Kết quả điện di

Giếng

...

...

...

Kết quả

Thang chuẩn ADN

Các vạch sách rõ ràng

Điện di tốt

Mẫu đối chứng dương

Có

Hỗn hợp phản ứng PCR tốt

Không

Mẫu đối chứng dương hỏng hoặc enzyme hỏng

...

...

...

Có

Bị tạp nhiễm

Không

Không tạp nhiễm

Mẫu thử

Có

Dương tính với Streptococcus agalactiae

Không

Âm tính với Streptococcus agalactiae

...

...

...

Điều kiện phản ứng được công nhận khi: kết quả của mẫu đối chứng dương (có giá trị Ct đã biết trước) phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct = ±2 Ct, mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct).

Với điều kiện như trên, mẫu dương tính là mẫu có giá trị Ct ≤ 35, sản phẩm sau khi chạy Realtime PCR tiếp tục điện di có kích thước vạch sáng 190 bp.

Mẫu âm tính là mẫu không có Ct hoặc mẫu có giá trị Ct ≤ 35 nhưng sản phẩm sau khi điện di không có vạch sáng hay vạch sáng không có kích thước 190 bp.

Mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 và sản phẩm sau khi chạy Realtime PCR tiếp tục điện di có kích thước vạch sáng 190 bp được coi là nghi ngờ.

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp khác để khẳng định.

7  Kết luận

Cá được xác định là mắc bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây ra khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh và kết quả dương tính với một trong hai phương pháp:

- Phân lập, định danh được vi khuẩn Streptococcus agalactiae.

- Phản ứng Realtime PCR phát hiện dương tính Streptococcus agalactiae.

...

...

...

PHỤ LỤC A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1  Môi trường thạch BA (thạch máu)

Thành phần:

Special nutrient substrate

23,0 g

Starch

1,0 g

...

...

...

5,0 g

Agar

13,0 g

Nước cất vô trùng

1000 ml

Máu ngựa hoặc cừu vô trùng

5 %

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần (trừ máu ngựa hoặc cừu) với nước cất trong chai tam giác vô trùng. Điều chỉnh pH 7,3 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 phút. Làm nguội 45 °C đến 50 °C. Cho 5ml máu cừu hoặc máu ngựa vào 95 ml môi trường, trộn đều và đổ đĩa.

...

...

...

A.2  Môi trường thạch chọn lọc Chromagar Strep B

Thành phần:

Peptone và yeast extract 20,0 g

Muối 7,5 g

Hỗn hợp Chromogenic 2,2 g

Thạch 15,0 g

Nước cất vô trùng 1010 ml

Chất bổ sung (supplement) S1 8 ml

Chất bổ sung (supplement) S2 0,25 g

...

...

...

Hòa tan các thành phần (trừ chất bổ sung) với 1000 ml nước cất trong chai tam giác vô trùng. Thêm 8ml chất bổ sung S1 vào dung dịch huyền phù trên. Khuấy đều cho đến khi thạch tan hết. Điều chỉnh pH 7,3 ± 0.2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 phút. Làm nguội 45 °C đến 50 °C.

Hòa tan 0,25 g chất bổ sung S2 vào 10 ml nước cất.

Dùng lọc tiệt trùng và cho 10 ml chất bổ sung S2 vào môi trường đã làm nguội 45 °C đến 50 °C. Lắc hoặc khuấy nhẹ để đồng nhất môi trường, đổ vào đĩa petri vô trùng.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng thạch Chromagar Strep B thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.3  Môi trường thạch dinh dưỡng TSA

Thành phần:

Peptone từ casein 15,0 g

Peptone từ đậu nành 5,0 g

NaCl 5,0 g

...

...

...

Nước cất vô trùng 1000 ml

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần với nước cất trong chai tam giác vô trùng. Điều chỉnh pH 7,3 ± 0.2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút. Làm nguội 45 °C đến 50 °C, trộn đều và đổ đĩa.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường thạch TSA thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.4  Môi trường canh BHI

Thành phần:

Chất dinh dưỡng (chiết xuất từ não, tim và peptone) 27,5 g

Glucose 2,0 g

NaCl 5,0 g

...

...

...

Nước cất vô trùng 1000 ml

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần với nước cất trong chai tam giác vô trùng. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 phút. Điều chỉnh pH 7,4 ± 0.2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường BHI thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.5  Môi trường kiểm tra tính chất sinh hóa

Sử dụng card định danh vi khuẩn gram dương hoặc kít kiểm tra sinh hóa theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Phụ lục B

(Quy định)

...

...

...

B.1  Thuốc nhuộm

B.1.1  Dung dịch kết tinh tím

Tím tinh thể

2,0 g

Ethanol 95%

20,0 ml

Amoni oxalat

0,8 g

Nước cất

...

...

...

Hòa tan tím tinh thể trong etanol, hòa tan amino oxalat trong nước cất. Sau đó trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

B.1.2  Dung dịch fucshin đậm đặc

Basic fucshin

1 g

Ethanol 95%

10 ml

Phenol (axit phenic)

5 g

Nước cất

...

...

...

Khi dùng, pha loãng dung dịch fucshin theo tỉ lệ 1/10 với nước cất.

B.1.3  Dung dịch lugol

Kali iodua

2 g

Iodua tinh thể

1 g

Nước cất

200 ml

Nghiền Kali iodua và iodua tinh thể, cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan

...

...

...

Ethanol 95%

3 phần

Axeton

1 phần

B.2  Tiến hành nhuộm

- Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản: từ 1 phút đến 2 phút, rửa nước nhanh, để khô

- Nhỏ dung dịch lugol: để 1 phút, rửa nước nhanh, để khô.

- Nhỏ cồn-axeton, rửa nước nhanh, để khô.

- Nhỏ dung dịch fucshin loãng: để 1 phút, rửa nước, thấm khô hoặc sấy khô.

...

...

...

- Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học bằng vật kính độ phóng đại 100 lần.

- Vi khuẩn gram dương bắt màu tím.

- Vi khuẩn gram âm bắt màu hồng..

Phụ lục C

(Tham khảo)

Kỹ thuật tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt

Cụ thể, gồm các bước như sau:

- Chuyển 1 ml dịch tăng sinh vào ống eppendorf. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.

...

...

...

- Bổ sung 250 μl nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để trộn đều sinh khối.

- Đặt ống eppendort vào block nhiệt khô 95°C trong 20 phút.

- Đặt ống eppendort vào khay đá để giảm nhanh nhiệt độ từ nóng xuống lạnh trước khi ly tâm.

- Ly tâm ở nhiệt độ từ 20°C đến 25°C tốc độ 10000 vòng/phút trong 3 phút.

- Chuyển 100 μl dịch nổi bên trên chứa ADN sang 1 ống mới.

ADN sau tách chiết bảo quản 4°C đến 8°C trong 24 giờ, hoặc lưu -20°C nếu chưa thực hiện phản ứng ngay.

CHÚ THÍCH: Kỹ thuật tách chiết ADN vi khuẩn có thể sử dụng bộ kit tách chiết ADN cho kết quả tương đương, ví dụ kit InViMag Bacteria DNA kit/KFml, Catalogue Number: 24331504502)

Phụ lục D

...

...

...

Phương pháp Realtime PCR phát hiện vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây bệnh ở cá bằng đoạn mồi IGS

D.1 - Trình tự cặp mồi

Bảng D.1 - Trình tự cặp mồi

Mồi

Trình tự (5'-3')

Kích cỡ sản phẩm

bp

Mồi xuôi IGS-F

GGA AAC CTG CCA TTT GCG TCT

...

...

...

Mồi ngược IGS-R

AAT CTA TTT CTA GAT CGT GGA AT

D.2 - Thực hiện phản ứng Realtime PCR

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị và kit nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng D.2

VÍ DỤ: Realtime PCR dùng kít nhân gen Power SYBR Green PCR Master Mix, Catalogue Number: PN 4367659 của hãng Applied Biosystems3).

Bảng D.2.1 - Thành phần phản ứng Realtime PCR

STT

Thành phần

...

...

...

μM

Thể tích

μl

1

Nước không có DNAse/RNAse

6

2

Dung dịch Master mix 2X

...

...

...

12,5

3

Mồi xuôi IGS-F

10

0,75

4

Mồi ngược IGS-R

10

0,75

...

...

...

20

5

ADN mẫu tách chiết

5

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu đối chứng dương: cho 5 μl mẫu ADN tách chiết đã được giám định hoặc sử dụng các mẫu chuẩn.

- Mẫu đối chứng âm: cho 5 μl nước không có enzyme phân hủy ADN/ARN, hoặc là mẫu ADN vi khuẩn âm tính với Streptococcus agalactiae.

- Mẫu thử: cho 5 μl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

...

...

...

Bảng D.2.2 - Chu trình nhiệt cho phản ứng Realtime PCR*

Nhiệt độ

°C

Thời gian

Số chu kỳ

50

2 phút

1

95

...

...

...

1

94

30 giây

40

60

1 phút

95

15 giây

1

...

...

...

1 phút

1

95

30 giây

1

60

15 giây

1

Chú thích: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít Power SYBR Green PCR Master Mix, Cat.No: PN 4367659 (Applied Biosystems)³⁾.

...

...

...

- Chuẩn bị thạch 1,5 %: cho 1,5 g agarose (3.2.8) vào lọ thủy tinh chịu nhiệt, bổ sung thêm 100 ml TBE 0,5X, đun dung dịch thạch trong lò vi sóng và mang ra lắc nhẹ sau mỗi 30 giây cho đến khi thạch tan hoàn toàn. Mang lọ thạch ra khỏi lò vi sóng và đợi đến khi nhiệt độ thạch bên trong lọ giảm xuống còn khoảng 50 °C.

- Cho 2,5 μl Gelred (3.2.9) vào 25 ml thạch 1,5 % (thể tích này sử dụng cho 17 giếng hoặc 25 giếng) và lắc đều nhẹ nhàng để Gelred hòa tan hoàn toàn, tránh tạo bọt khí. Sau đó đổ thạch vào khuôn đã có gắn sẵn lược, chờ khoảng 1 giờ để thạch đông.

- Khi bản thạch đã đông, nhẹ nhàng lấy lược ra và tránh làm vỡ thạch. Đặt thạch vào bồn điện di có chứa dung dịch TBE 1X, phải đảm bảo dung dịch TBE ngập khỏi bản thạch.

- Các sản phẩm PCR được pha với dung dịch loading dye 6X (3.2.10). Sau đó cho hỗn hợp này vào giếng thạch.

- Hút 7 μl thang chuẩn cho vào giếng cuối cùng.

- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V đến 100 V.

- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa bỏ thuốc nhuộm bằng cách ngâm trong nước 45 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV, chụp ảnh

Phụ lục E

...

...

...

Sơ đồ chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae trong phòng thí nghiệm

Hình F.1 - Sơ đồ chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn

Hình F.2 - Sơ đồ chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp Realtime PCR

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Y-L Su & J Feng & J-S Bai và A-X Li, 2016. Development of a quantitative PCR assay for monitoring Streptococcus agalactiae colonization and tissue tropism in experimentally infected tilapia. Journal of Fish Diseases 39 (2016) 229-238.

[2] ISO 20837:2006, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens- Requirements for sample preparation for qualitative detection.

...

...

...

[4] Đồng Thanh Hà và ctv, 2009. Một số đặc điểm của Streptococcus agalactiae - Tác nhân gây bệnh Streptococcosis trên cá rô phi ở miền bắc Việt Nam.

[5] St. Xavier’s College, Kathmandu, Nepal, 2018. Biochemical Test and Identification of Streptococcus agalactiae. Sagar Aryal; sag.micro@gmail.com; Department of Microbiology.

1) Kít nhân gen là SYBR Green PCR không có nhiệt độ phát tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu cho vi khuẩn Streptococcus agalatiae, vì vậy cần có thêm bước điện di để kết luận.

2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-21:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá