C.2  Thực hiện phản ứng Nested RT - PCR

Kỹ thuật nested RT- PCR bao gồm 2 giai đoạn (hoặc 2 bước):

Giai đoạn 1 (bước 1): Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi F2/R3 đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng (xem bảng C.2).

VÍ DỤ: Kit nhân gen SuperScript" III One-Step RT-PCR with Platinum" Taq. Cat: 12574-0263)

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng RT - PCR

Thành phần

Nồng độ (µM)

Thể tích cho 1 phản ứng (µl)

...

...

...

7,5

Dung dịch 2x Reaction Mix

12,5

Mồi F2

20

1

Mồi R3

...

...

...

1

Enzyme Tag Mix

0,5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

22,5

Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 2,5 µl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng VNN chuẩn.

Mẫu đối chứng âm: Cho 2,5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

...

...

...

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.3).

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ^[7]

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Số chu kỳ

50

15 min

1

94

...

...

...

94

15 s

35

55

30 s

68

60s

68

5 min

...

...

...

Sau đó, lấy sản phẩm bước 1 ra để chuẩn bị cho phản ứng bước 2 - Nested RT - PCR

Giai đoạn 2 (bước 2): Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi F’2/R’3 đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kit nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) Cat K0171)4)

Thành phần cho 1 phản ứng bước 2 (xem Bảng C.4).

Bảng C.4 - Thành phần phản ứng Nested RT - PCR

Thành phần

Nồng độ (µM)

Thể tích cho 1 phản ứng (µl)

Nước không có ARN/DNA

...

...

...

7,5

Dung dịch Master Mix

12,5

Mồi F’2

20

1

Mồi R’3

20

...

...

...

Tổng thể tích thực hiện 1 phản ứng

22

Chuyển 22 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 3 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới.

Mẫu đối chứng âm: Cho 3 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới.

Mẫu thử: Cho 3 µl mẫu sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới

Tiến hành phản ứng Nested RT-PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.5).

Bảng C.5 - Chu trình nhiệt của phản ứng Nested RT - PCR bước 2 ^[7]

Nhiệt độ (°C)

...

...

...

Số chu kỳ

95

2 min

1

95

40 s

25

55

40 s

...

...

...

60 s

72

10 min

1

Sau khi kết thúc chu trình nhiệt của phản ứng Nested RT - PCR tiến hành điện di theo mục (6.1.3.4)

Phụ lục D

(Quy định)

Phương pháp Realtime RT- PCR phát hiện VNN

...

...

...

Bảng D.1 - Trình tự cặp mồi ^[7]

Tên mồi và đoạn dò

Trình tự

Kích thước sản phẩm, bp

RNA 2 FOR

5’-CAA-CTG-ACA-RCG-AHC-ACA-C - 3’

69

RNA 2 REV

5’-CCC-ACC-AYT-TGG-CVA-C - 3’

...

...

...

5’- TYC-ARG-CRA-CTC-GTG-GTG-CVG*- 3’

D.2  Thực hiện phản ứng Realtime RT -PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi đặc hiệu RNA 2 FOR / RNA 2 REV (3.2.2) đã được chuẩn bị sử dụng kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kit nhân gen Invitrogen superscript III qRT-PCR kit Cat.No: 11732-0885)

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng D.2):

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng Realtime RT- PCR

Thành phần

Nồng độ (µM)

Thể tích cho 1 phản ứng (µl)

...

...

...

5,5

Dung dịch 2X reaction mix

12,5

Mồi RNA 2 FOR

20

0,5

Mồi RNA 2 REV

...

...

...

0,5

Đoạn dò RNA 2 probe

10

0,5

Enzym

0,5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

20

...

...

...

- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 5 µl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng VNN chuẩn.

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

- Mẫu thử: Cho 5 µl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng Realtime RT- PCR bằng máy Realtime PCR (4.1.2) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng D.3).

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime RT- PCR

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Số chu kỳ

50

...

...

...

01

95

2 min

01

95

15 s

40

60 (*)

30 s

...

...

...

Phụ lục E

(Tham khảo)

Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

E.1  Xử lý mẫu

Chuyển khuôn chứa mẫu sang ngâm etanol 70 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 30 đến 60 min;

Ngâm sang etanol 90 % (3.1.1) trong thời gian từ 30 đến 60 min;

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 đến 60 min;

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ hai trong thời gian từ 30 đến 60 min;

...

...

...

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ hai trong thời gian từ 30 đến 90 min;

Ngâm tẩm parafin (3.3.5) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 đến 90 min;

Ngâm tẩm parafin (3.3.5) lần thứ hai, thời gian 120 min;

CHÚ THÍCH: Tất cả các thao tác trên có thể được thực hiện trong máy xử lý mẫu mô tự động (4.2.2).

Đúc khuôn:

Sau đó, đưa mẫu vào khung đúc parafin: rót parafin nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4) chuyên dụng;

Gắp bệnh phẩm vào rồi đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên;

Để nguội, tách lấy khối parafin.

E.2  Cắt tiêu bản

...

...

...

Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các tổ chức;

Cắt lấy tiêu bản, độ dày lát cắt từ 3 µm đến 5 µm;

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng và lấy được hết các mô cần lấy, thả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) có nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C;

Dùng lam kính (4.2.10) vớt dán lát cắt, chuyển sang máy sấy mẫu (4.2.13) có nhiệt độ 40°C trong 2 đến 3h.

E.3  Nhuộm tiêu bản Haematoxylin và Eosin

Tẩy parafin trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong etanol 100 % (3.1.1) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong etanol 90 % (3.1.1) để từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong etanol 70 % (3.1.1) để từ 3 min đến 5 min;

...

...

...

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin (3.3.3) từ 3 min đến 5 min;

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong thuốc nhuộm từ Eosin (3.3.4) từ 3 min đến 5 min;

Loại bỏ nước còn bám trên phiến kính bằng cách:

Nhúng qua etanol 70 % (3.1.1) để từ 2 đến 3 min; sau đó nhúng qua etanol 100 % (3.1.1) 3 lần (3 cốc), mỗi lần để từ 2 đến 3 min; chuyển sang ngâm trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần từ 2 min đến 3 min; Lau sạch xung quanh và gắn lamen (4.2.9) bằng keo dán.

Để khô tự nhiên và soi dưới kính hiển vi quang học (4.2.8).

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, Bệnh học Thủy sản, 2004, trang 112-116.

...

...

...

[3] TCVN 8710-02: 2011 Quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá biển (VNN).

[4] TCVN 1-2: 2008 Xây dựng tiêu chuẩn - Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.

[5] Mori, K., Mangyoku, T, Iwamoto, T, Arimoto, M, Tanaka, S, Nakai, T, 2003. Serological relationships among genotypic variants of Betanodavirus. Diseases of Aquatic Organisms. 57: p. 19-26.

[6] Munday, B.L., Kwang, J., Moody, N., 2002. Betanodavirus infections of teleost fish: a review. Journal of Fish Diseases, 25: 127-142.

[7] Oie. 2017. Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animails.Chapter 2.3.12. Viral encephalopathy and retinopathy.

[8] Johansen, R., Grove, S., Svendsen, A.K., Modahl, l., Dannevig, B.H, A., 2004. Sequential study of pathological findings in Alantic halibut, Hippoglossus hippoglossus (L), throughout one year after an acute outbreak of viral encephalopathy and retinopathy. Journal of Fish Diseases. 27: p. 327-341.

[9] Tanaka, S., Takagi, M., Miyazaki, T.,2004. Histopathological studies on viral nervous necrosis of sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus Thunburg, at the grow-out stage. Journal of Fish Diseases. 27: p. 385-399.

[10] FAO/NACA. 2001 Bệnh viêm não và võng mạc do Virus (VER). Hướng dẫn chuẩn đoán bệnh động vật thủy sản Châu Á- - tài liệu kỹ thuật Thủy sản FAO 402/2.

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

...

...

...

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

4) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

5) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển