6.2.2  Phương pháp PCR

6.2.2.1  Nguyên tắc

Phương pháp phân tích này nhằm xác định ADN của mầm bệnh có hay không tồn tại trong mẫu kiểm tra dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có được khuếch đại hay không. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm được phát hiện thông qua kỹ thuật PCR, Realtime PCR, với ADN được tách chiết từ canh tăng sinh hoặc từ mẫu mô bệnh của tôm với các biểu hiện triệu chứng điển hình nhằm rút ngắn tối đa thời gian xét nghiệm.

6.2.2.2  Tăng sinh vi khuẩn

Mẫu sau khi xử lý (xem 6.1.2) được tăng sinh trong môi trường pepton kiềm (xem 3.3.1) theo tỷ lệ 1:10, ủ ở tủ ấm (xem 4.1.3) từ 28 °C đến 30 °C từ 18 giờ đến 24 giờ.

CHÚ Ý: Khi xét nghiệm mẫu tôm có triệu chứng, bệnh tích điển hình có thể tách chiết ADN trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm mà không cần phải qua bước tăng sinh (Mẫu bệnh phẩm được nghiền thành huyễn dịch 10 % với dung dịch PBS (xem Phụ lục A). Sau đó ly tâm 1500 g trong 10 phút. Thu dịch nổi dùng cho tách chiết ADN vi khuẩn)

6.2.2.3  Tách chiết ADN (Xem thêm phụ lục C)

Mẫu sau khi tăng sinh (xem 6.2.2.2) được dùng để chiết tách ADN. Tiến hành tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt (xem phụ lục C) hoặc dùng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Sau khi chiết tách, ADN được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản ở âm 20 °C hoặc âm 80 °C (xem 4.1.1) chờ đến khi tiến hành xét nghiệm.

...

...

...

Các bước tiến hành phản ứng tham khảo Phụ lục D.

Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính sử dụng cặp mồi AP3. Chuẩn bị các mồi ở nồng độ 10 µM với nước tinh khiết không có DNase/RNase (xem 3.3.4).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng PCR theo hướng dẫn của bộ kít sử dụng. Ví dụ sử dụng bộ kít Taq PCR Master Mix kit, Catalogue Number: 2014431) của hãng Qiagen.

Thực hiện điện di sản phẩm: Sau khi khi kết thúc chương trình chạy máy PCR, lấy các ống chứa sản phẩm khuếch đại ra khỏi máy và giữ ở 4 °C để chuẩn bị cho quá trình điện di.

LƯU Ý: Mẫu ADN và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

6.2.2.5  Điện di và đọc kết quả

Các bước tiến hành tham khảo phụ lục D, D.3

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel theo Bảng 2:

Bảng 2 - Kết quả điện di

...

...

...

Vạch 336 bp

Kết quả

Thang chuẩn ADN

Các vạch sáng rõ ràng

Điện di tốt

Mẫu đối chứng dương

Có

Hỗn hợp phản ứng PCR tốt

Không

...

...

...

Mẫu đối chứng âm

Có

Bị tạp nhiễm

Không

Không tạp nhiễm

Mẫu thử

Có

Dương tính với AHPND

Không

...

...

...

Đánh giá kết quả: Điều kiện phản ứng được công nhận khi: đối chứng dương có kích thước vạch sáng 336 bp so với thang chuẩn và đối chứng âm không xuất hiện bất kỳ vạch sáng nào.

Mẫu dương tính là mẫu được phát hiện đồng thời với đối chứng dương có cùng vạch sáng có chiều dài 336 bp so với thang chuẩn.

Mẫu âm tính là mẫu không có vạch sáng có chiều dài 336 bp

6.2.3  Phương pháp Realtime PCR

6.2.3.1  Nguyên tắc

Xem 6.2.2.1

6.2.3.2  Tăng sinh vi khuẩn

Xem 6.2.2.2

6.2.3.3  Tách chiết ADN

...

...

...

6.2.3.4  Tiến hành phản ứng

Các bước tiến hành tham khảo Phụ lục E.

Phương pháp Realtime PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính sử dụng cặp mồi và mẫu dò VpPirA.

Chuẩn bị các mồi và mẫu dò ở nồng độ 10 µM với nước tinh khiết không có DNase/RNase (4.3.4).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng realtime PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng, Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix Platinum^® Quantitative PCR SuperMix - UDG, Cat. No.: 11730-0172) của hãng Invitrogen

LƯU Ý: Mẫu ADN và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

6.2.3.5  Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct). Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct dao động trong khoảng ± 2 Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó.

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct < 35 được coi là dương tính. Mẫu không có giá trị Ct là âm tính. Mẫu có giá trị 35 ≤ Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.

...

...

...

7  Kết luận

Tôm được xác định là mắc bệnh AHPND do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình và kết quả dương tính với một trong các xét nghiệm: phản ứng PCR hoặc phản ứng Realtime PCR

Phương pháp nuôi cấy, phân lập3) và định danh vi khuẩn chỉ kết luận được đến loài Vibrio parahaemolyticus. Vì vậy cần kết hợp với phương pháp Realtime PCR hoặc PCR để xác định gen sinh độc tố gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính của vi khuẩn này.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) pH 7,2

A.1.1  Thành phần:

...

...

...

8,0 g

Kali clorua (KCl)

0,2 g

Natri hydrophosphat (Na₂HPO₄)

1,15g

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄)

0,2 g

Nước cất

1000 ml

...

...

...

Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Môi trường thạch chọn lọc TCBS

A.2.1  Thành phần:

Yeast extract

5,0 g

Proteose Peptone

10,0 g

Sodium thiosulfate

...

...

...

Sodium citrate

10,0 g

ŌX gall

5,0 g

Sodium cholate

3,0 g

Saccharose

20,0 g

Sodium chloride

...

...

...

Ferric citrate

1,0 g

Bromothymol blue

0,04 g

Thymol blue

0,04 g

Thạch

Từ 8,0 đến 18 g4)

Nước cất

...

...

...

A.2.2  Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh môi trường khô trong nước, đun đến khi sôi. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần. Không hấp áp lực.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường thạch TCBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.3  Môi trường thạch dinh dưỡng TSA 1% muối

A.3.1  Thành phần:

Peptone từ casein

15,0g

Peptone từ đậu nành

5,0g

...

...

...

10,0g

Thạch

15,0g

Nước cất

1000ml

A.3.2  Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần với nước cất trong chai tam giác vô trùng. Điều chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút. Làm nguội đến 45 - 50°C, trộn đều và đổ đĩa.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường thạch TSA thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.4  Môi trường pepton kiềm

...

...

...

Peptone                                    20,0 g

NaCl                                         20,0 g

Nước cất                                  1000 ml

A.4.2  Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần với nước cất trong chai vô trùng. Điều chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng peptone kiềm thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.5  Các môi trường nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

Sử dụng card định danh vi khuẩn gram âm hoặc kít kiểm tra sinh hóa theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Gram

B.1  Thuốc nhuộm

B.1.1  Dung dịch kết tinh tím

Tím tinh thể

2,0 g

Ethanol 95%

20,0 ml

Amoni oxalat

...

...

...

Nước cất

80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol, hòa tan amino oxalat trong nước cất. Sau đó trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

B.1.2  Dung dịch fucshin đậm đặc

Basic fucshin

1 g

Ethanol 95%

10 ml

Phenol (axit phenic)

...

...

...

Nước cất

100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch fucshin theo tỉ lệ 1/10 với nước cất.

B.1.3  Dung dịch lugol

Kali iodua

2 g

Iodua tinh thể

1 g

...

...

...

200 ml

Nghiền Kali iodua và iodua tinh thể. cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan.

B.1.4  Cồn-axeton

Ethanol 95%

3 phần

Axeton

1 phần

B.2  Tiến hành nhuộm

...

...

...

- Nhỏ dung dịch lugol: để 1 phút, rửa nước nhanh, để khô.

- Nhỏ cồn-axeton, rửa nước nhanh, để khô.

- Nhỏ dung dịch fucshin loãng: để 1 phút, rửa nước, thấm khô hoặc sấy khô.

B.3  Xem tiêu bản

- Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học bằng vật kính độ phóng đại 100 lần.

- Vi khuẩn gram dương bắt màu tím.

- Vi khuẩn gram âm bắt màu hồng.

Phụ lục C

...

...

...

Kỹ thuật tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt

Cụ thể, gồm các bước như sau:

- Chuyển 1 ml dịch tăng sinh vào ống eppendorf. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.

- Huyền phù sinh khối trong 1ml nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để sinh khối được trộn đều trong nước. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.

- Bổ sung 250 µl nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để trộn đều sinh khối.

- Đặt ống eppendorf vào block nhiệt khô 95°C trong 20 phút.

- Đặt ống eppendort vào khay đá để giảm nhanh nhiệt độ từ nóng xuống lạnh trước khi ly tâm.

- Ly tâm ở nhiệt độ từ 20°C đến 25°C tốc độ 10000 vòng/phút trong 3 phút.

- Chuyển 100 µl dịch nổi bên trên chứa ADN sang 1 ống mới.

...

...

...

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở tôm bằng đoạn mồi AP3

D.1  Trình tự cặp mồi

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát hiện gen của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND theo Bercovier TK (OIE, 2017)

Bảng D.1 - Trình tự cặp mồi

Mồi

Trình tự (5'-3')

...

...

...

bp

Mồi xuôi AP3-F

ATG AGT AAC AAT AT A AAA CAT GAA AC

336

Mồi ngược AP3-R

GTG GTA ATA GAT TGT ACA GAA

D.2  Thực hiện phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị và kit nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng D.2

...

...

...

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng PCR

STT

Thành phần

Nồng độ

µM

Thể tích

µl

1

Nước không có DNAse/RNAse

...

...

...

8,5

2

Dung dịch Master mix 2X

12,5

3

Mồi xuôi AP3-F

10

0,5

...

...

...

Mồi ngược AP3-R

10

0,5

Tổng thể tích

22

Chuyển 22 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu đối chứng dương: cho 3 µl mẫu ADN tách chiết đã được giám định hoặc sử dụng các mẫu chuẩn.

- Mẫu đối chứng âm: cho 3 µl nước không có enzyme phân hủy ADN/ARN, hoặc là mẫu ADN vi khuẩn âm tính với Vibrio parahaemolyticus.

- Mẫu thử: cho 3 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

...

...

...

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR*

Nhiệt độ

°C

Thời gian

Số chu kỳ

94 (*)

3 phút (*)

1

94

...

...

...

30

53

30 giây

72

40 giây

72

5 phút

1

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít HotstarTag^®Master Mix, Cat. No.: 203445 (Qiagen).

...

...

...

- Chuẩn bị thạch Agarose (3.3.5) 1,5 % pha trong dung dịch TBE (3.3.5) 0,5X bổ sung chất nhuộm gel (3.3.6) (ví dụ như: gel red) với tỷ lệ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).

- Thạch khô, rút lược ra và cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X.

- Cho mẫu vào các giếng (10 µl sản phẩm PCR + 2 µl dung dịch dung dịch nạp mẫu (3.3.7)).

- Sử dụng thang chuẩn ADN (3.3.8).

LƯU Ý: Khi chạy điện di sản phẩm PCR phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm.

- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V - 100 V.

- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp, chụp ảnh.

...

...

...

(Tham khảo)

Phương pháp Realtime PCR phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở tôm bằng đoạn mồi VpPirA

E.1  Trình tự cặp mồi và đoạn dò

Bảng E.1 - Trình tự cặp mồi và đoạn dò

Mồi và đoạn dò

Trình tự (5' - 3')

Mồi xuôi VpPirA-F

TTG GAC TGT CGA ACC AAA CG

Mồi ngược VpPirA-R

...

...

...

Đoạn dò VpPirA-P

FAM - AGA CAG CAA ACA TAC ACC TAT CAT CCC GGA - TAMRA

E.2  Thực hiện phản ứng Realtime PCR

Sử dụng cặp mồi và đoạn dò đã được chuẩn bị và kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng E.2.

VÍ DỤ: sử dụng bộ kít Master mix Platinum^® Quantitative PCR SuperMix - UDG, Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen.

Bảng E.2 - Thành phần phản ứng Realtime PCR

STT

Thành phần

Nồng độ

...

...

...

(µl)

1

Nước không có DNAse/RNAse

5,5

2

Dung dịch SuperMix

2X

12,5

...

...

...

Mồi xuôi VpPirA-F

10 pM

0,75

4

Mồi ngược VpPirA-R

10 pM

0,75

5

Đoạn dò VpPirA-P

...

...

...

0,5

Tổng thể tích

20

- Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp Master mix tiến hành:

+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml;

+ Cho 5 µl ADN vừa tách chiết vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix;

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có ADNse/RNase vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl ADN dương chuẩn của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND (mẫu ADN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

...

...

...

Bảng E.3 - Chu trình nhiệt cho phản ứng Realtime PCR *

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

50 °C (*)

2 phút (*)

1

95 °C (*)

2 phút (*)

...

...

...

15 giây

40

60 °C

30 giây

(Ghi nhận tín hiệu quang)

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít PlatinumQuantitative PCR SuperMix-UDG, Cat. No.: 11730-017.

PHỤ LỤC F

(Quy định)

...

...

...

Hình F.1 - Sơ đồ chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trong phòng thí nghiệm

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE 2018 chapter 2.2.1 Acute Hepatopancreatic Necrosic Disease.

[2] TCCS 02: 2014/TY-TS: Tiêu chuẩn cơ sở phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có gen gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm bằng kỹ thuật PCR (Quyết định ban hành số 934/QĐ-TY-TS ngày 12 tháng 12 năm 2014 của Cục trưởng Cục Thú y).

[3] TCCS 01: 2016/TY-TS: Quy trình xét nghiệm phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có gen gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm bằng kỹ thuật Real-time PCR (Quyết định ban hành số 453/QĐ-TY-TS ngày 01 tháng 07 năm 2016 của Cục truởng Cục Thú y).

[4] Jee Eun Han, Kathy F.J.Tang, Carlos R. Pantoja, Brenda L. White, Donald V. Lightner, 2015. qPCR assay for detecting and quantifying a virulence plasmid in acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) due to pathogenic Vibrio parahaemolyticus. Aquaculture 442 (2015) 12-15.

[5] ISO 20837:2006, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens- Requirements for sample preparation for qualitative detection.

...

...

...

[7] Chapter VI - Laboratory identification of Vibrio cholerae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae, Centers for Disease Control and Prevention.

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

3) Phương pháp nuôi cấy phân lập thường được sử dụng để phục vụ kiểm tra kháng sinh đồ cũng như lưu giữ gốc vi khuẩn gây bệnh dùng cho các nghiên cứu.

4) Tùy thuộc sức đông của thạch

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm