Cặp mồi 254F/ 254R dùng để khuếch đại đoạn gen của Rickettsia- like bacteria có kích thước 254 bp.

Chuẩn bị mồi như sau:

Chuẩn bị mồi gốc:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.4) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên.

- Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.3.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 μM làm mồi gốc.

Chuẩn bị mồi sử dụng:

- Mồi sử dụng ở nồng độ 20 μM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết (3.3.10) (10 μl mồi gốc và 90 μl nước tinh khiết).

6.2.4.3  Tiến hành phản ứng PCR

Sử dụng một trong hai cặp mồi đã chuẩn bị (6.2.4.2) và sử dụng kít nhân gen (3.3.2) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

Thành phần cho một phản ứng được nêu trong bảng 2.

Bảng 2 - Thành phần phản ứng PCR

Thành phần

Thể tích, μl

Dung dịch nhân gen (Taq PCR Master Mix)

12,5

Mồi xuôi 20 μM

1

Mồi ngược 20 μM

...

...

...

Nước tinh khiết không có nuclease

7,5

Tổng thể tích

22

Chuyển 22 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 3 μl mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng Rickettsia- like bacteria chuẩn vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 3 μl nước tinh khiết (3.3.10) vào ống phản ứng;

- Mẫu thử: Cho 3 μl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.3.1) đã cài đặt chu trình nhiệt được nêu trong bảng 3.

...

...

...

Nhiệt độ, ^oC

Thời gian

Số chu kỳ, vòng

95

5 min

1

65

30 s

30

...

...

...

30 s

95

30 s

65

60s

1

72

2 min

CHÚ THÍCH:

...

...

...

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.2.4.4  Điện di

6.2.4.4.1  Chuẩn bị bản thạch

Pha thạch với nồng độ agarose (3.3.4) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.3.5) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 ^oC đến 50 ^oC thì bổ sung 10 μl chất nhuộm màu (3.3.6) cho 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều;

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm;

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch;

Chuyển bản thạch vào bể chạy điện di (4.3.5), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (3.3.5) cùng loại với dung dịch pha thạch đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe ADN gel stain3)) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

...

...

...

Hút 2 μl chất đệm tải mẫu (3.3.7) vào 8 μl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.3.5), chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.3.9) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 μl thang chuẩn ADN (3.3.9) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.

6.2.5  Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.3.6) theo bảng 5.

Bảng 5 - Kết quả điện di

Giếng

Vạch 254 bp

Kết quả

...

...

...

Sáng và chia vạch rõ ràng

Điện di tốt

Mẫu kiểm chứng dương

Có

Hỗn hợp phản ứng PCR tốt

Không

Mẫu đối chứng dương hỏng

hoặc enzym hỏng

Mẫu kiểm chứng âm

...

...

...

Không bị tạp nhiễm

Có

Bị tạp nhiễm

Mẫu thử

Có

Dương tính với Rickettsia- like bacteria

Không

Âm tính với Rickettsia- like bacteria

Đánh giá kết quả:

...

...

...

Kết quả mẫu thử âm tính khi: Tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng. Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng, mẫu kiểm chứng dương có kích thước 254 bp.

6.3  Kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp mô bệnh học

6.3.1  Lấy mẫu

Xem 6.2.1.

6.3.2  Chuẩn bị và bảo quản mẫu

- Mẫu tôm còn sống tiến hành giải phẫu để thu các mô đích: gan tụy, mang, dạ dày;

- Cắt một phần mô đích (< 1 cm³), cố định mẫu trong dung dịch Davidson (3.4.6) với tỷ lệ thể tích 1 : 10;

- Đối với mô lớn cần tiêm dung dịch Davidson (3.4.6) vào trong mô đích trước khi ngâm trong dung dịch Davidson;

- Mẫu cố định trong dung dịch Davidson từ 36 h đến 48 h và bảo quản ở etanol 70 % (thể tích) (3.1.1) trong khoảng thời gian từ 24 h đến 72 h tùy thuộc vào kích thước mẫu. Phải dùng các dụng cụ vô trùng khi lấy mô ở các mẫu khác nhau để tránh lây nhiễm;

...

...

...

CHÚ THÍCH: Không dùng tôm chết hoặc tôm bảo quản đông lạnh để cắt mô.

6.3.3  Cách tiến hành

6.3.3.1  Đúc khuôn

Đặt khuôn nhựa (4.4.1) rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 đến 3 h;

Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.4.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

...

...

...

Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.4.5) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.4.5) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy xử lý mẫu mô tự động (4.4.2) thì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol.

- Đúc khuôn: rót parafin (3.4.5) nóng chảy từ nồi đun parafin (4.4.3) vào khay sắt (4.4.4), gắp bệnh phẩm từ khuôn nhựa đặt vào khay sắt, đặt khuôn nhựa (4.4.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối paratin.

6.3.3.2  Cắt tiêu bản

- Cắt gọt khối parafin cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh (4.4.5);

- Đặt khối paraffin lên máy cắt tiêu bản (4.4.6) sao cho mặt khối paraffin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các tổ chức;

- Cắt lấy tiêu bản, độ dày lát cắt từ 3 μm đến 5 μm;

- Chọn lát cắt tiêu bản phẳng và lấy được hết các mô cần lấy, thả vào nồi dãn tiêu bản (4.4.7) có nhiệt độ nước từ 35 ^oC đến 40 ^oC;

...

...

...

6.3.3.3  Nhuộm tiêu bản

- Ngâm tiêu bản (6.3.3.2) vào cốc xylen (3.4.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.4.3), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.4.4), thời gian từ 60 s đến 90 s;

...

...

...

- Loại bỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.4.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.1.2) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.4.7). Để khô, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (4.1.3).

6.3.4  Đọc kết quả

Mẫu dương tính khi thấy sự hiện diện của Rickettsia- like bacteria ký sinh nội bào ở mô liên kết của gan tụy và mang tạo nên các đám bắt màu tím của hematoxylin. Sự biến đổi mô học đặc thù ở tổ chức gan tụy thể hiện ở việc Rickettsia- like bacteria bao vây xung quanh các mạch máu nhỏ ở giai đoạn sớm của bệnh, sau đó chúng tấn công vào trong các mạch máu, tồn tại tự do trong đó và làm máu chuyển đục.

7  Kết luận

Tôm hùm được xác định là nhiễm bệnh sữa do Rickettsia- like bacteria khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh và có kết quả dương tính một trong ba phương pháp sau:

- Phát hiện Rickettsia- like bacteria trong máu tôm hùm bằng phương pháp nhuộm Giemsa;

- Có kết quả dương tính với Rickettsia- like bacteria bằng phương pháp PCR;

- Thể hiện những dấu hiệu mô học đặc trưng cho bệnh sữa.

Phụ lục A

...

...

...

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1  Dung dịch Giemsa đậm đặc

A.1.1  Thành phần

Giemsa (dạng bột)

1,0 g

Glyxerin

66 ml

Cồn metanol nguyên chất

66 ml

...

...

...

Làm nóng glyxerin trong bể ủ nhiệt (4.2.2). Thêm thuốc nhuộm Giemsa trộn đều và ủ trong 2 h. Sau đó để nguội và thêm cồn metanol và giữ trong khoảng 2 tuần trước khi sử dụng.

Khi sử dụng pha loãng theo tỷ lệ 1 : 10 (thể tích) trong dung dịch đệm phosphat 0,01 M (pH = 7,0) và giữ trong 30 min.

A.2  Dung dịch đệm phosphat

A.2.1  Thành phần

Dung dịch natri hydrophosphat

9,47 g

Dung dịch kali dihydrophosphat

9,08 g

Nước cất

...

...

...

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan natri hydrophosphat, kali dihydrophosphat trong nước cất và lắc cho tan hết.

A.3  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.3.1  Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X

100 ml

Nước đã khử ion

900 ml

Tổng: 1000 ml dung dịch TAE (hoặc TBE) 1X

...

...

...

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hoà chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.4  Thuốc nhuộm Hematoxylin (dung dịch Hematoxylin - Mayer)

A.4.1  Thành phần

Hematoxylin dạng tinh thể

1 g

Natri iodat

0,2 g

Amoni alum sulfat (hoặc kali alum sulfat)

...

...

...

Axit citric

1 g

Chloral hydrat

50 g

Nước cất

1 000 ml

A.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum sulfat hoặc kali nhôm sulfat, hoà tan, tiếp tục cho axit citric và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

...

...

...

A.5.1  Thành phần

Eosin Y

1 g

Etanol 70 % (thể tích)

1 lít

Axit axetic

5 ml

A.5.2  Chuẩn bị

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 % (thể tích) (3.1.1). Hoà tan eosin trong cồn, sau đó thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

...

...

...

A.6  Dung dịch Davidson

A.6.1  Thành phần

Etanol tuyệt đối (3.1.1)

330 ml

Formalin (dung dịch nước bão hòa khí formaldehyd, từ 36 % đến 38 %) 220 ml

Axit acetic

115 ml

Nước cất

355 ml

...

...

...

Hòa tan axit acetic, formalin và etanol trong 355 ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hoá chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hoá chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít tách chiết ADN: DNAeasy^® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506):

- Nhỏ 20 μl protease K vào ống ly tâm 1,5 ml;

- Chuyển 30 mg bệnh phẩm (hoặc từ 100 μl đến 200 μl bệnh phẩm máu) (6.2.1) vào ống ly tâm đã có protease K;

...

...

...

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.4);

- Ủ ấm ở 56 ^oC trong 10 min, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.4);

- Thêm 200 μl etanol tuyệt đối (3.1.1) vào ống ly tâm;

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.4);

- Hút 420 μl huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thêm 500 μl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thay ống thu ở dưới cột ly tâm;

...

...

...

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.3.2) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;

- Chuyển cột ly tâm sang ống ly tâm 1,5 ml;

- Nhỏ 200 μl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.3.2) với tốc độ 6 000 g trong 1 min;

- Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml khác.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Diseases of aquatic organisms, 2010. Dis Aquat Org - Vol. 91: 105-112.

[2] Ngô Nguyên Vũ, Hoàng Tùng, Lê Thanh Long, Hew Choy Leong, Trần Bích Ngọc, Nguyễn T.T. Hoài, Review on Milky Haemolymph Syndrome caused by Rickettsia-like bacteria (RLB) on Spiny Lobster and experimental culture of RLB on Grouper Embryonic Cell line (GE)

[3] Milky Haemolymph Disease of Spiny Lobsters - Aquatic Animal Diseases Significant to Australia. OIE Aquatic Animal Disease Cards. 2007.

...

...

...

[5] Nguyễn Chí Thuận, Phạm Ngọc Long, Nguyễn Quang Vinh, Nguyễn Thị Thành Lợi, 2012. Đặc điểm hình thái và trình tự Gen 16S rRNA của vi khuẩn tương tự Rickettsia (RLB) ở Tôm hùm bông (Panulirus ornatus) bị bệnh sữa. Tạp chí Công nghệ Sinh học số 10, 151 -157.

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-17:2016 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm