- Lấy mẫu mỗi loại bệnh phẩm, cho vào từng lọ hay túi nilon vô trùng riêng biệt, đậy kín, thao tác lấy mẫu, dụng cụ đựng mẫu và tiếp xúc với mẫu phải đảm bảo vô trùng.

6.1.2. Bảo quản mẫu.

Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 24 h hoặc bảo quản trong etanol tuyệt đối (3.1.1);

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong etanol tuyệt đối (3.1.1).

6.1.3. Chuẩn bị mẫu.

Bệnh phẩm: cá nguyên con vô trùng bên ngoài bề mặt cá bằng etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), dùng panh, kéo vô trùng lấy phần cơ bên cạnh hoặc bên dưới vết loét.

Lượng mẫu cần chuẩn bị: khoảng 30 mg.

6.1.4. Cách tiến hành.

6.1.4.1. Tách chiết ADN.

...

...

...

VÍ DỤ. Sử dụng kit tách chiết DNeasy^® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506)1) (xem phụ lục B).

6.1.4.2. Chuẩn bị mồi.

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.1.1) theo phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của A. invadans sử dụng cặp mồi ITS1-2F/ITSR1 (3.2.1). Trình tự cặp mồi được nêu trong bảng 1.

Bảng 1: Trình tự cặp mồi

Mồi

Trình tự cặp mồi

ITS1-2F

5’-TCA-TTG-TGA-GTG-AAA-CGG-TG-3’

ITSR1

...

...

...

Cặp mồi ITS1-2F/ITSR1 dùng để khuếch đại đoạn gen của nấm A invadans có kích thước 234 bộ

Mồi được chuẩn bị như sau:

Chuẩn bị mồi gốc:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.4) ở gia tốc 6 000g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng đệm TE (3 2 6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 µM làm mồi gốc.

Chuẩn bị mồi sử dụng:

- Mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).

6.1.4.3. Tiến hành phản ứng PCR.

Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (6.1.4.2) sử dụng kit nhân gen (3.2.9) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656)2)

...

...

...

Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR

Thành phần

Thể tích

Taq PCR Master Mix Kit

12,5 µl

Mồi xuôi 20 µM

1 µl

Mồi ngược 20 µM

1 µl

...

...

...

8 µl

Tổng thể tích

22,5 µl

Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 2,5 µl mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng Aphanomyces invadans chuẩn vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 µl nước (3.2.8) vào ống phản ứng;

- Mẫu thử: Cho 2,5 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) để cài đặt chu trình nhiệt và được nếu trong bảng 3.

Bảng 3 : Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

...

...

...

Thời gian

Số chu kỳ

95 °C

2 min

1

94 °C

30 s

35

56 °C

...

...

...

72 °C

2,5 min

72 °C

5 min

1

CHÚ THÍCH.

- Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

6.1.4.4. Điện di.

...

...

...

Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.2) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.3) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.4) cho 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều;

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm;

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch;

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.1.5), đổ dung dịch đệm (3.2.3) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe ADN gel stain3)) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.1.4.4.2. Chạy điện di.

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (3.2.5) vào 8 µl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.1.5), chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.2.7) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn AND (3.2.7) vào một giếng trên bản thạch

...

...

...

6.1.4.5. Đọc kết quả.

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.1.6) theo bảng 4.

Bảng 4 : Kết quả điện di

Giếng

Sản phẩm có kích thước 234 bp

Kết quả

Thang chuẩn ADN

Sáng và chia vạch rõ ràng

Điện di tốt

...

...

...

Có

Hỗn hợp phản ứng PCR tốt

Không

Mẫu đối chứng dương hỏng hoặc enzym hỏng

Mẫu kiểm chứng âm

Không

Không bị tạp nhiễm

Có

Bị tạp nhiễm

...

...

...

Có

Dương tính với EUS

Không

Âm tính với EUS

Đánh giá kết quả:

- Kết quả mẫu thử dương tính khi: tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 234 bp. Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu kiểm chứng dương có kích thước 234 bp, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng.

- Kết quả mẫu thử âm tính khi: tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng. Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu kiểm chứng dương có kích thước 234 bp, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng.

6.2. Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp parafin.

6.2.1. Lấy mẫu.

...

...

...

6.2.2. Bảo quản mẫu.

Mẫu bệnh phẩm được đảm bảo ngập trong formalin (3.3.1), tránh đổ vỡ, rơi vãi formalin (3.3.1) ra ngoài môi trường; khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon, miệng túi được dán kín. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay mẫu phải được bổ sung hoặc thay mới fomalin (3 3.1), đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin (3.3.1) đạt tỷ lệ khoảng 1 - 10.

6.2.3. Chuẩn bị mẫu.

- Đối với cá giống cố định cả con;

- Đối với cá trưởng thành cố định bằng cách lấy cá sống cắt lấy phần da, mô cơ (< 1 cm³) xung quanh vết loét;

- Mẫu bệnh phẩm cố định trong formalin (3.3.1) từ 24 h đến 72 h tùy thuộc vào kích thước mẫu;

6.2.4. Cách tiến hành.

6.2.4.1. Đúc khuôn.

- Đặt khuôn nhựa (4.2.1) rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h;

...

...

...

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h:

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.3.5) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.3.5) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy xử lý mẫu mô tự động (4.2.2) thì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol.

- Đúc khuôn: rót parafin (3.3.5) nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4), gắp bệnh phẩm từ khuôn nhựa đặt vào khay sắt (4.2.4), đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin.

...

...

...

- Cắt gọt khối parafin (6.2.4.1) cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.2.5),

- Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các bệnh phẩm, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 µm đến 5 µm, cắt một vài lát;

- Chọn lát cắt phẳng thả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) với nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C

Dùng phiến kính (4.2.8) vớt dán lát cắt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô.

6.2.4.3. Nhuộm tiêu bản

- Ngâm tiêu bản (6.2 4 2) vào cốc xylen (3.3.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min;

...

...

...

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.3 3), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.3.4), thời gian từ 60 s đến 90 s;

- Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Loại bỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1 1) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.3.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.2.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.3.6). Để khô, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (4.2.10).

6.2.5. Đọc kết quả.

Mẫu mô được soi dưới kính hiển vi quang học (4.2.10) cho thấy sự hiện diện của các khối u hình tròn màu trắng không bắt màu của H & E;

Giai đoạn sớm quan sát thấy sợi nấm tại vị trí hoại tử thể hiện ở những chấm đen nhỏ trên tiêu bản nhuộm. Dần hình thành những u hạt nấm màu trắng.

7. Kết luận

...

...

...

- Phản ứng PCR phát hiện nấm A. Invadans dương tính

- Mẫu cắt mô thể hiện những dấu hiệu bệnh tích vi thể đặc trưng cho hội chứng lở loét trên cá.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1. Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1. Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X:

...

...

...

Nước khử ion:

900 ml

Tổng

1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2. Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

...

...

...

A.2. Thuốc nhuộm Hematoxylin (dung dịch Hematoxylin - Mayer)

A.2.1. Thành phần

Hematoxylin dạng tinh thể:

1 g

Natri iodat:

0,2 g

Amoni alum sulphate:
(hoặc Postasium alum sulphate)

...

...

...

Axit citric:

1 g

Chloral hydrate:

50 g

Nước:

1000 ml

...

...

...

A.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan Hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và Amoni alum sulphate hoặc kali nhôm sulfat, hòa tan, tiếp tục cho axit citric và chloral hydrate rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.3. Thuốc nhuộm Eosin

A.3.1. Thành phần

Eosin Y

1 g

Etanol 70 % (thể tích)

...

...

...

Axit axetic:

5 ml

A.3.2. Chuẩn bị

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 % (thể tích). Hòa tan eosin trong cồn, sau đó thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị trong chai tối màu.

PHỤ LỤC B

...

...

...

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNAeasy^® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506):

- Nhỏ 20 µl protease K vào ống Iy tâm 1,5 ml;

- Chuyển 30 mg bệnh phẩm (6.1.3) vào ống ly tâm đã có protease K;

- Thêm 200 µl dung dịch AL (Lysis buffer):

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.4);

- Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4 1.4):

- Thêm 200 µl etanol tuyệt đối (từ 96 % đến 100 %) (3.1.1) vào ống ly tâm;

...

...

...

- Hút 420 µl huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ống thu ở dưới:

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thêm 500 µl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thay ống thu ở dưới cột ly tâm;

- Thêm 500 µl dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới:

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.2) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;

- Chuyển cột ly tâm sang ống ly tâm 1,5 ml;

- Nhỏ 200 µl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

...

...

...

- Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml khác.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] AAHRI - J.H. Lilley. R.B. Callinan. S. Chinabut, S. Kanchanaknan,l.H. MacRse end M.J. Phillips. 2002. Epizootic Ulcerative Syndrome (EUS) Technical Handbook. The Aquatic Animal Health Research Institute, Bangkok.

[2] D.A.Huchzermeyer. Benjamin C.W van der Waal. 2012. Epizootic ulcerative syndrome. Exotic fish disease threatens Africa’s aquatic ecosystems. Journal of the South African Veterinary Association, September 2012.

[3] FAO and NACA - Asia Diagnosstic Guide to Aquatic Animal Diseases. Fisheries technical paper 402/2, Page 52, 88.

[4] Lilley J.H., Callinan R.B., Chinabut S., Kanchanakhan S., MacRae I.H. & Phillips M.J (1998) Epizootic ulcerative syndrome (EUS) technical handbook. Aquatic Animal Health Research Institute, Bangkok, Thailand.

[5] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội. 2004. Bệnh học thủy sản NXB NN.

[7] Phạm Minh Đức, Khoa Thủy sản, ĐH Cần Thơ. Hội chứng lở loét ở cá - Epizootic Ulcerative Syndrome (EUS).

...

...

...

2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-14:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá