Cặp mồi H441F/ H441R dùng để khuếch đại đoạn của gen HPV có kích thước 441 bp.

Mồi được chuẩn bị như sau:

Chuẩn bị mồi gốc:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.4) ở gia tốc 6 000g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 mM làm mồi gốc.

Chuẩn bị mồi sử dụng

- Mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (10 ml mồi gốc và 90 ml nước).

6.1.4.3. Tiến hành phản ứng PCR.

Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (6.1.4.2) sử dụng kít nhân gen (3.2.9) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656) 2)

...

...

...

Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR

Thành phần

Thể tích

Taq PCR Master Mix Kit

12,5 ml

Mồi xuôi 20 mM

1 ml

Mồi ngược 20 mM

1 ml

...

...

...

8 ml

Tổng thể tích

22,5 ml

Chuyển 22,5 ml hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Màu kiểm chứng dương: Cho 2,5 ml mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng Aphanomyces invadans chuẩn vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 ml nước (3.2.8) vào ống phản ứng;

- Mẫu thử: Cho 2,5 ml mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) đã cài đặt chu trình nhiệt và được nêu trong bảng 3.

Bảng 3 : Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

...

...

...

Thời gian số chu kỳ

Số chu kỳ

95 ^oC

5 min

1

95 ^oC

1 min

35

60 ^oC

...

...

...

72 ^oC

1 min

72 ^oC

1 min

1

CHÚ THÍCH:

- Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.1.4.4. Điện di.

...

...

...

Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.2) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.3) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 ^oC đến 50 ^oC thì bổ sung 10 ml chất nhuộm màu (3.2.4) cho 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều;

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm;

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch;

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.1.5), đổ dung dịch đệm (3.2.3) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe ADN gel stain 3)) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.1.4.4.2. Chạy điện di.

Hút 2 ml chất đệm tải mẫu (3.2.5) vào 8 ml sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.1.5), chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.2.7) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 ml thang chuẩn AND (3.2.7.) vào một giếng trên bản thạch.

...

...

...

6.1.4.5. Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.1.6) theo bảng 4.

Bảng 4: Kết quả điện di

Giếng

Sản phẩm có kích thước 441 bp

Kết quả

Thang chuẩn

Sáng và chia vạch rõ ràng

Điện di tốt

...

...

...

Có

Hỗn hợp phản ứng PCR tốt

Không

Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng hoặc enzym hỏng

Mẫu kiểm chứng âm tính

Không

Không bị tạp nhiễm

có

Bị tạp nhiễm

...

...

...

có

Dương tính với HPV

Không

Âm tính với HPV

Đánh giá kết quả:

- Kết quả mẫu thử dương tính khi: tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 441 bp, thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu kiểm chứng dương có kích thước 441 bp, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng.

- Kết quả mẫu thử âm tính khi: tại giếng mẫu thử không có vạch sáng, thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu kiểm chứng dương tính có vạch sáng 441 bp, mẫu kiểm chứng âm tính không có vạch sáng.

6.2. Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp parafin.

6.2.1. Lấy mẫu.

...

...

...

6.2.2. Bảo quản mẫu.

- Mẫu bệnh phẩm được đảm bảo ngập trong Davidson (3.3.3) đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và Davidson (3.3.3) đạt tỷ lệ khoảng 1 : 10; tránh đổ vỡ, rơi vãi Davidson (3.3.3) ra ngoài môi trường; khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon, miệng túi được dán kín. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bổ sung Davidson (3.3.3) hoặc thay mới bằng formalin (3.3.1), đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin (3.3.1.) đạt tỷ lệ khoảng 1 : 10.

3.2.3. Chuẩn bị mẫu.

Đối với tôm giống và hậu ấu trùng lấy nguyên con:

Đối với tôm bố mẹ hoặc tôm thương phẩm cắt toàn bộ phận giáp đầu ngực (< 1 cm³);

Mẫu bệnh phẩm cố định trong Davidson (3.3.3) khoảng từ 24 h đến 72 h tùy thuộc vào kích thước mẫu;

Mẫu bệnh phẩm được chuyển sang cố định trong formalin 10 % (3.3.1) không quá 24 h.

Mẫu bệnh phẩm cố định trong formalin 10% ra, cắt miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm cho vào khuôn nhựa (4.2.1).

6.2.4. Cách tiến hành.

...

...

...

- Đặt khuôn nhựa (4.2.1) rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.3.6) lần thứ nhất trong thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.3 6) lần thứ hai, thời gian từ 2 h đến 3 h;

...

...

...

- Đúc khuôn rót parafin (3.3.6) nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4), gặp bệnh phẩm từ khuôn nhựa đặt vào khay sắt (4.2.4), đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin.

6.2.4.2. Cắt tiêu bản.

- Cắt gọt khối parafin (6.2.4.1) cho bằng phẳng, đặt lên trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.2.5).

- Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các bệnh phẩm, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 mm đến 5 mm, cắt một vài lát;

- Chọn lát cắt phẳng thả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) với nhiệt độ nước từ 35 ^oC đến 40 ^oC.

Dùng phiến kính (4.2.8) vớt dán lát cắt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô.

6.2.4.3. Nhuộm tiêu bản

- Ngâm tiêu bản (6.2.4.2) vào cốc xylen (3.3.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

...

...

...

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.3.4), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.3.5), thời gian từ 60 s đến 90 s;

- Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;;

- Loại bỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.3.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.2.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.3.7). Để khô, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (4.2.10).

6.2.5. Đọc kết quả.

Mẫu dương tính khi có dấu hiệu mô học đặc thù của HPV được thể hiện dưới dạng 1 thể vùi trong nhân tế bào phình to. Thời kỳ đầu thể vùi này nằm ở trung tâm của nhân sau lớn dần lên nằm gần kín nhân, thường có dạng hình cầu hoặc hơi bầu dục. Trong các tế bào bị cảm nhiễm vi rút hạch nhân cũng phình to hơn các tế bào bình thường khác.

...

...

...

7. Kết luận

Mẫu tôm được xác định là nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử gan tụy (HPV) khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và có kết quả dương tính một trong hai phương pháp sau:

- Phản ứng PCR phát hiện HPV dương tính;

- Mẫu cắt mô thể hiện những dấu hiệu bệnh tích vi thể đặc trưng cho bệnh HPV trên tôm.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ THUỐC THỬ

A.1. Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

...

...

...

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X:

100 ml

Nước khử ion:

900 ml

Tổng:

1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2. Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

...

...

...

A.2. Dung dịch Davidson

A.2.1. Thành phần

Etanol tuyệt đối:

330 ml

Formalin:

220 ml

(dung dịch nước bão hòa khí formaldehyde là dung dịch từ 36 % đến 38 %)

Axit acetic:

115 ml

...

...

...

355 ml

A.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan axit acetic, formalin và etanol tuyệt đối trong 355 ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.3. Thuốc nhuộm Hematoxylin (dung dịch Hematoxylin – Mayer)

A.3.1. Thành phần

Hematoxylin dạng tinh thể:

1 g

Natri iodat:

...

...

...

Amoni alum sulphate:

50 g

(hoặc Postasium alum sulphate)

Axit citric:

1 g

Chloral hydrate:

50 g

Nước:

1000 ml

...

...

...

Hòa tan Hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum sulphate hoặc postasium alum sulphate, hòa tan, tiếp tục cho axit citric và chloral hydrate rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.4. Thuốc nhuộm Eosin

A.4.1. Thành phần

Eosin Y:

1 g

Etanol 70 % (thể tích):

1 lít

Axit axetic:

...

...

...

A.4.2. Chuẩn bị

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 % (thể tích). Hòa tan eosin trong cồn, sau đó thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị trong chai tối màu.

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy^®Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506):

...

...

...

- Chuyển 30 mg mẫu bệnh phẩm (6.1.3) vào ống ly tâm đã có protease K;

- Thêm 200 ml dung dịch AL (Lysis buffer);

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.4);

- Ủ ấm ở 56 ^oC trong 10 min, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.4);

- Thêm 200 ml etanol tuyệt đối vào ống ly tâm;

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.4);

- Hút 420 ml huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng:

- Thêm 500 ml dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới;

...

...

...

- Thay ống thu ở dưới cột ly tâm;

- Thêm 500 ml dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;

- Chuyển cột ly tâm sang ống ly tâm 1,5 ml;

- Nhỏ 200 ml dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min;

- Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml khác.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] E. Manjanaik, K. R. Umesha, Indrani Karunasagar, Iddya Karunasagar, 2005. Detection of nepatopancreatic parvovirus (HPV) in wild shrimp from India by nested polymerase chain reaction (PCR)

[3] Jurairat Phromjai, Vichai Boonsaeng, Boonsirm Withyachumnarnkul, Timothy W. Flegel, Detection of hepatopancreatic parvovirus in Thai shrimp Penaeus monodonby in situhybridization, dot blot hybridization and PCR amplification, Diseases of aquatic organisms Dis Aquat Org, 2002, 51. p 227-232.

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-13:2005 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm