C.2  Thực hiện phản ứng PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi (3.2.1) đã được chuẩn bị sử dụng kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng C.2).

VÍ DỤ: Sử dụng kit nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656)[4]⁾

Bảng C.2 - Thành phần cho 1 phản ứng

Thành phần

Nồng độ gốc

Thể tích cho 1 phản ứng (µl)

Nước không có ARN/ADN

...

...

...

6,5

PCR Master Mix (2X)

12,5

Mồi EHP 510 F

20 µM

0,5

Mồi EHP 510 R

20 µM

...

...

...

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

20

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl mẫu ADN tách chiết từ mẫu dương tính chuẩn với EHP.

Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 5 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) theo chu trình nhiệt (xem Bảng C.3).

Bảng C.3 - Chu kỳ luân nhiệt đối với máy PCR

Nhiệt độ (°C)

...

...

...

Số chu kỳ

95

3 min

01

95

30 s

35

60

30 s

...

...

...

30 s

72

5 min

Giữ ở 4 °C đến khi tắt máy

CHÚ THÍCH:

- Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng.

...

...

...

(Quy định)

Phương pháp Realtime PCR phát hiện EHP

D.1  Trình tự cặp mồi

Bảng D.1 - Trình tự cặp mồi và đoạn dò^[4]

Tên mồi

Trình tự

Kích thước sản phẩm, bp

EHP-F157

5'-AGT AAA CTA TGC CGA CAA-3'

...

...

...

EHP-R157

5-AAT TAA GCA GCA CAA TCC-3'

Probe 157

5'-FAM-TCC TGG TAG TGT CCT TCC GT-TAMRA-3'

D.2  Thực hiện phản ứng Realtime PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi đặc hiệu EHP-F157, EHP-R157, Probe 157 đã được chuẩn bị sử dụng kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit nhân gen của Platinum^® Quantitative PCR SuperMix-UDG, Cat.No: 11730-017[5]⁾

Bảng D.2 - Thành phần của phản ứng realtime PCR

Thành phần

...

...

...

Thể tích cho 1 phản ứng (µl)

Nước không có RNA/ADN

6

Dung dịch 2X reaction mix

12,5

Mồi EHP 157 F

10 µM

...

...

...

Mồi EHP 157 R

10 µM

1

Probe 157

10 µM

0,5

Tổng thể tích

21

Chuyển 21 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

...

...

...

Mẫu đối chứng âm: Cho 4 µl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 4 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.2) theo chu trình nhiệt trong Bảng 6.

Bảng 6 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Số chu kỳ

50

02 min

...

...

...

95

02 min

01

95

15 s

40

60 (*)

30 s

CHÚ THÍCH BẢNG: (*) Nhiệt độ và thời gian này phù hợp với máy realtime PCR ABI 7500

...

...

...

Phụ lục E

(Quy định)

Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

E.1  Xử lý mẫu

Chuyển khuôn chứa mẫu sang ngâm etanol 70 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 30 đến 60 min.

Ngâm sang etanol 95 % (3.1.1) trong thời gian 30 đến 60 min.

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 đến 60 min.

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ hai trong thời gian từ 30 đến 60 min.

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ nhất trong thời gian từ 60 đến 90 min.

...

...

...

Ngâm tẩm parafin (3.3.6) lần thứ nhất trong thời gian 90 min.

Ngâm tẩm parafin (3.3.6) lần thứ hai, thời gian từ 120 min.

CHÚ THÍCH: Tất cả các thao tác trên có thể được thực hiện trong máy xử lý mẫu mô tự động (4.2.2).

Đúc khuôn

Đưa mẫu vào khung đúc parafin: Rót parafin nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4) chuyên dụng.

Gắp bệnh phẩm vào rồi đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên.

Để nguội, tách lấy khối parafin.

E.2  Cắt tiêu bản

Cắt gọt khối parafin cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh (4.2.5).

...

...

...

Cắt lấy tiêu bản, độ dày lát cắt từ 3 µm đến 5 µm.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng và lấy được hết các mô cần lấy, thả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) có nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C.

Dùng lam kính (4.2.8) vớt những lát cắt bằng phẳng, chuyển sang máy sấy ở 40°c trong 2 đến 3 h.

E.3  Nhuộm tiêu bản

Tẩy parafin trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong etanol 100 % (3.1.1) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong etanol 95 % (3.1.1) để từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong etanol 70 % (3.1.1) để từ 3 đến 5 min.

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 đến 5 min.

...

...

...

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm từ Eosin (3.3.5) từ 3 đến 5 min.

Nhúng qua etanol 70 % (3.1.1) để từ 2 đến 3 min; sau đó nhúng qua etanol 100 % (3.1.1) 3 lần (3 cốc), mỗi lần để từ 2 đến 3 min; chuyển sang ngâm trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần từ 2 đến 3 min; lau sạch xung quanh và gắn lamen (4.2.9) bằng keo dán.

Để khô tự nhiên và soi dưới kính hiển vi quang học (4.2.10).

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004, Bệnh học thủy sản, NXB Nông nghiệp.

[2] Diseases of Crustaceans - Hepatopancreatic microsporidiosis caused by Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), Disease Card EHP - OIE 2015.

[3] Luis FernandoArangurenJee EunHanKathy F.J.Tang. Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) is a risk factor for acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) and septic hepatopancreatic necrosis (SHPN) in the Pacific white shrimp Penaeus vannamei Aquaculture Volume 471, 20 March 2017, Pages 37-42

...

...

...

[5] Somjintana Tourtip, Somjai Wongtripop, Grant D. Stentiford, Kelly S. Bateman, Siriporn Sriurairatana, Jittipan Chavadej, Kallaya Sritunyalucksana, Boonsirm WithyachumnADNkul. September 2009. Enterocytozoon hepatopenaei sp. nov. (Microsporida: Enterocytozoonidae), a parasite of the black tiger shrimp Penaeus monodon (Decapoda: Penaeidae): Fine structure and phylogenetic relationships. J Invertebr Pathol. 2009 Sep;102(1):21-9

[6] Tang KF¹, Pantoja CR², Redman RM², Han JE², Tran LH³, Lightner DV Development of in situ hybridization and PCR assays for the detection of Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), a microsporidian parasite infecting penaeid shrimp.J Invertebr Pathol. 2015 Sep; 130:37-41.

[7] Tangprasittipap A¹, Srisala J, Chouwdee s, Somboon M, Chuchird N, Limsuwan C, Srisuvan T, Flegel TW, Sritunyalucksana K. The microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei is not the cause of white feces syndrome in whiteleg shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei. BMC Vet Res. 2013 Jul 15;9:139. doi: 10.1186/1746-6148-9-139.

[8] Tiêu chuẩn cơ sở TCCS 03: 2016/TY-TS Quy trình phát hiện vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei gây bệnh ở tôm.

[9] TCVN 8710 -12: 2015 Quy trình chẩn đoán bệnh Vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm.

[10] TCVN 1-2: 2008 Xây dựng tiêu chuẩn - Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.

[1]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[2]⁾ Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[3]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương

...

...

...

[5]⁾ Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bảo tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm