Cặp mồi MF1/ MR1 dùng để khuếch đại đoạn gen của Enterocytozoon hepatopenaei có kích thước 951 bp.

Mồi được chuẩn bị như sau:

Chuẩn bị mồi gốc:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 µM làm mồi gốc.

Chuẩn bị mồi sử dụng

- Mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).

6.1.4.3. Tiến hành phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (6.2.4.2) sử dụng kít nhân gen (3.2.10) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656) 2)

...

...

...

Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR

Thành phần

Thể tích

Taq PCR Master Mix Kit

12,5 µl

Mồi xuôi 20 µM

1,25 µl

Mồi ngược 20 µM

1,25 µl

...

...

...

7,5 µl

Tổng thể tích

22,5 µl

Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu kiểm chứng dương: Cho 2,5 µl mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng Enterocytozoon hepatopenaei chuẩn.

Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 µl nước (3.2.8).

Mẫu thử: Cho 2,5 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt được nêu trong bảng 3.

Bảng 3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ^[1]

...

...

...

Thời gian

Số chu kỳ

94 °C

30 s

35

55 °C

30 s

72 °C

90 s

...

...

...

5 min

1

CHÚ THÍCH:

- Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm:

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.1.4.4. Điện di

6.1.4.4.1. Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.2) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.3) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.4) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

...

...

...

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.2.5), đổ dung dịch đệm (3.2.3) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe ADN gel stain 3)) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.1.4.4.2. Chạy điện di

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (3.2.5) vào 8 µl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.2.5), chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.2.7) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn ADN (3.2.7) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.

6.1.4.5. Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.2.6) theo bảng 4.

...

...

...

Giếng

Sản phẩm có kích thước 951 bp

Kết quả

Thang chuẩn ADN

Sáng và chia vạch rõ ràng

Điện di tốt

Mẫu kiểm chứng dương tính

Có

Hỗn hợp phản ứng PCR tốt

...

...

...

Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng hoặc enzym hỏng

Mẫu kiểm chứng âm tính

Không

Không bị tạp nhiễm

Có

Bị tạp nhiễm

Mẫu thử

Có

Dương tính với vi bào tử

...

...

...

Âm tính với vi bào tử

Đánh giá kết quả:

Kết quả mẫu thử dương tính khi: tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 951 bp. Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu kiểm chứng dương có kích thước 951 bp, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng.

Kết quả mẫu thử âm tính khi: tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng. Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu kiểm chứng dương có kích thước 951 bp, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng.

6.2. Kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp parafin

6.2.1. Lấy mẫu

Xem 6.1.1.

6.2.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm được đảm bảo ngập trong Davidson (3.3.3) đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và Davidson (3.3.3) đạt tỷ lệ khoảng 1 : 10, tránh đổ vỡ, rơi vãi Davidson (3.3.3) ra ngoài môi trường; khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon, miệng túi được dán kín. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bổ sung Davidson (3.3.3) hoặc thay mới bằng formalin (3.3.1), đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin (3.3.1) đạt tỷ lệ khoảng 1 : 10.

...

...

...

Đối với tôm giống và hậu ấu trùng lấy nguyên con;

Đối với tôm bố mẹ hoặc tôm thương phẩm cắt toàn bộ phận giáp đầu ngực (< 1 cm³);

Mẫu bệnh phẩm cố định trong Davidson (3.3.3) khoảng từ 24 h đến 72 h tùy thuộc vào kích thước mẫu;

Mẫu bệnh phẩm được chuyển sang cố định trong formalin 10 % (3.3.1) không quá 24 h.

Lấy mẫu bệnh phẩm cố định trong formalin 10% ra, cắt miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm cho vào khuôn nhựa (4.3.1).

6.2.4. Cách tiến hành

6.2.4.1. Đúc khuôn

Đặt khuôn nhựa (4.3.1) rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 h đến 3 h;

...

...

...

Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.3.6) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.3.6) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy xử lý mẫu mô tự động (4.3.2) thì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol.

Đúc khuôn: rót parafin (3.3.6) nóng chảy từ nồi đun parafin (4.3.3) vào khay sắt (4.3.4), gắp bệnh phẩm từ khuôn nhựa đặt vào khay sắt, đặt khuôn nhựa (4.3.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin.

6.2.4.2. Cắt tiêu bản

...

...

...

- Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.3.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các tổ chức;

- Cắt lấy tiêu bản, độ dày lát cắt từ 3 µm đến 5 µm;

- Chọn lát cắt tiêu bản phẳng và lấy được hết các mô cần lấy, thả vào nồi dãn tiêu bản (4.3.7) có nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C;

- Dùng phiến kính (4.1.1) vớt dán lát cắt bằng, dựng nghiêng và để khô.

6.2.4.3. Nhuộm tiêu bản

- Ngâm tiêu bản (6.2.4.2) vào cốc xylen (3.3.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min;

...

...

...

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.3.4), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.3.5), thời gian từ 60 s đến 90 s;

- Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Loại bỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.3.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.1.2) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.3.7). Để khô, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (4.1.3).

6.2.5. Đọc kết quả

Mẫu dương tính khi thấy sự hiện diện của các vi bào tử trong tế bào chất của tế bào biểu mô gan tụy với các dấu hiệu mô học:

- Tế bào biểu mô ống gan tụy trương to, nhân bị phân hóa và chứa đầy các hạt ưa acid, tạo thành đám được bao quanh bởi lớp màng không bào và bắt màu hồng đỏ của eosin;

- Ống gan tụy của những con tôm bị nhiễm bệnh nặng bị giãn rộng, hoại tử (rỗng) và có thể chứa các giọt dầu;

...

...

...

6.3. Phương pháp nhuộm tiêu bản tươi

6.3.1. Lấy mẫu

Xem 6.1.1.

6.3.2. Bảo quản mẫu

Mẫu tôm được vận chuyển đến phòng thí nghiệm phải còn sống và được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C:

Tôm còn sống có những dấu hiệu lâm sàng đặc trưng của bệnh vi bào tử, được chuyển đến phòng thí nghiệm đựng trong túi nilon (chứa không quá 1/3 nước) có bơm oxy.

6.3.3. Chuẩn bị mẫu

Mẫu sử dụng nhuộm tiêu bản tươi phải còn sống hoặc vừa mới chết.

Tách phần giáp đầu ngực và lấy khối gan tụy bên trong rồi đặt lên lam kính (4.1.1) sạch.

...

...

...

Dùng lamen tán nhỏ khối gan tụy, dàn mỏng khối gan tụy trên lam kính, nhỏ từ 2 giọt đến 3 giọt thuốc nhuộm lugol odine (3.4.1) và đậy lamen lên rồi quan sát dưới kính hiển vi;

Quan sát với vật kính 10 X, 40 X và 100 X.

6.3.5. Đọc kết quả

Mẫu tôm dương tính nếu quan sát dưới kính hiển vi (4.1.3) cho thấy sự xuất hiện của các vi bào tử có hình giọt nước, đứng thành từng đám một và bắt màu nâu xám của thuốc nhuộm lugol iodine;

Nếu quan sát ở vật kính 100 X cho thấy rõ hơn cấu tạo các bào tử:

- Các bào tử chưa trưởng thành được bao bọc bởi một lớp màng plasma bên trong và bên ngoài là lớp màng ngoại bào tử là protein;

- Ở bào tử trưởng thành có thể quan sát thấy nhân nằm sâu bên trong các sợi cực, đĩa bám và đĩa cực gồm nhiều phiến mỏng của nó.

7. Kết luận

Mẫu tôm được xác định nhiễm bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và: có kết quả dương tính một trong hai phương pháp sau:

...

...

...

- Mẫu cắt mô thể hiện những dấu hiệu bệnh tích vi thể đặc trưng cho bệnh vi bào tử.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1. Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1. Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml

Nước khử ion: 900 ml

...

...

...

A.1.2. Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2. Dung dịch Davidson

A.2.1. Thành phần

Etanol tuyệt đối: 330 ml

Formalin: 220 ml

(dung dịch nước bão hòa khí formaldehyde là dung dịch từ 36 % đến 38 %)

Axit acetic: 115 ml

...

...

...

A.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan axit acetic, formalin và etanol trong 355 ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.3. Thuốc nhuộm Hematoxylin (dung dịch Hematoxylin - Mayer)

A.3.1. Thành phần

Hematoxylin dạng tinh thể: 1 g

Natri iodat: 0,2 g

Amoni alum sulphate: 50 g

(hoặc Postasium alum sulphate)

...

...

...

Chloral hydrate: 50 g

Nước: 1000 ml

A.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum sulphate hoặc postasium alum sulphate, hòa tan, tiếp tục cho axit citric và chloral hydrate rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.4. Thuốc nhuộm Eosin

A.4.1. Thành phần

Eosin Y: 1 g

Etanol 70 % (thể tích) 1 lít

...

...

...

A.4.2. Chuẩn bị

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 % (thể tích) (3.1.1). Hòa tan eosin trong etanol, sau đó thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị trong chai tối màu.

A.5. Thuốc nhuộm lugol iodine

A.5.1. Thành phần

Kali iodua: 6 g

I-ốt: 4 g

Nước cất: 100 ml

A.5.2. Chuẩn bị

...

...

...

Dung dịch được giữ trong chai màu nâu ở nhiệt độ phòng để tránh sự kết tủa. Dung dịch có thể được giữ trong nhiều tuần nhưng nên thỉnh thoảng lọc để loại bỏ các hạt kết tủa có thể xuất hiện.

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít tách chiết DNeasy^® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506):

- Nhỏ 20 µl protease K vào ống ly tâm 1,5 ml;

- Chuyển 30 mg mẫu bệnh phẩm (6.1.3) vào ống ly tâm đã có protease K;

...

...

...

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4);

- Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4);

- Thêm 200 µl etanol tuyệt đối vào ống ly tâm;

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4);

- Hút 420 µl huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thêm 500 µl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thay ống thu ở dưới cột ly tâm;

...

...

...

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;

- Chuyển cột ly tâm sang ống ly tâm 1,5 ml,

- Nhỏ 200 µl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min;

- Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml khác.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Somjintana Tourtip, Somjai Wongtripop, Grant D. Stentiford, Kelly S. Bateman, Siriporn Sriurairatana, Jittipan Chavadej, Kallaya Sritunyalucksana, Boonsirm WithyachumnADNkul. September 2009. Enterocytozoon hepatopenaei sp. nov. (Microsporida: Enterocytozoonidae), a parasite of the black tiger shrimp Penaeus monodon (Decapoda: Penaeidae): Fine structure and phylogenetic relationships. Journal of Invertebrate PathologySydney M. Finegold, Ellen Jo Baron, 1986. Bailey diagnostic and scott's microbiology. Seventh edition.

[2] Amornrat Tangprasittipap, Jiraporn Srisala, Saisunee Chouwdee, Montagan Somboon, Niti Chuchird, Chalor Limsuwan, Thinnarat Srisuvan, Timothy W Flegel and Kallaya Sritunyalucksana. 15 July 2013. The microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei is not the cause of white feces syndrome in whiteleg shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei. http://www.biomedcentral.com/1746-6148/9/139.

...

...

...

[4] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004, Bệnh học thủy sản, NXB Nông nghiệp.

[5] Bùi Quang Tề, Lê Ngọc Quân, Nguyễn Thị Biên Thùy, Bùi Quang Tâm, Hoàng Thị Yến, Nguyễn Thị Niên, Nguyễn Văn Thành, Phan Thị Hường. 2010. Kết quả nghiên cứu bệnh gan tụy trên tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ở Việt Nam và biện pháp phòng ngừa.

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

3) Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12: Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon Hepatopenaei ở tôm