Cặp mồi PmarlTS-70F/PmarlTS600R dùng để khuếch đại đoạn gen của Perkinsus marinus có kích thước 509 bp.

Mồi được chuẩn bị như sau:

Chuẩn bị mồi gốc:

- Mồi gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.10) được mồi ở nồng độ 200 mM làm mồi gốc;

Chuẩn bị mồi sử dụng:

- Mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.5) (10 ml mồi gốc và 90 ml nước (3.2.5)).

6.2.4.3. Tiến hành phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (6.2.4.2) sử dụng kít nhân gen (3.2.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit nhân gen của Themo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656)2)

...

...

...

Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR

Thành phần

Thể tích

Taq PCR Master Mix (2X)

12,5 ml

Mồi xuôi 20 mM

1 ml

Mồi ngược 20 mM

1 ml

...

...

...

8 ml

Tổng thể tích

22,5 ml

Chuyển 22,5 ml hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 2,5 ml mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng Perkinsus marinus chuẩn vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 ml nước (3.2.5) vào ống phản ứng:

- Mẫu thử: Cho 2,5 ml mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt được nêu trong bảng 3.

Bảng 3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

...

...

...

Thời gian

Số chu kỳ

94 °C

4 min

1

94 °C

1 min

40

...

...

...

1 min

65 °C

3 min

65 °C

10 min

1

CHÚ THÍCH:

- Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

...

...

...

6.2.4.4.1. Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.6) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.7) vào bình thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 ml chất nhuộm màu (3.2.8) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều;

Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn rồi đổ thạch vào khuôn, không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm;

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch:

Chuyển bản thạch vào bể chạy điện di (4.2.6), đổ dung dịch đệm (3.2.7) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (ví dụ Sybr safe ADN gel stain3)) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.2.4.4.2. Chạy điện di

Hút 2 ml chất đệm tải mẫu (3.2.9) vào 8 ml sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

...

...

...

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.

6.2.4.5. Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả ở máy đọc gel (4.2.7) theo Bảng 4.

Bảng 4: Kết quả điện di

Giếng

Vạch 509 bp

Kết quả

Thang chuẩn ADN

Các vạch sáng rõ ràng

...

...

...

Mẫu kiểm chứng dương tính

Có

Hỗn hợp phản ứng PCR tốt

Không

Mẫu đối chứng dương tính hỏng hoặc enzym hỏng

Mẫu kiểm chứng âm tính

Có

Bị tạp nhiễm

Không

...

...

...

Mẫu thử

Có

Dương tính với Perkinsus marinus

Không

Âm tính với Perkinsus marinus

Đánh giá kết quả:

- Kết quả mẫu thử dương tính khi: Tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 509 bp. Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu kiểm chứng dương có kích thước 509 bp. mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng.

- Kết quả mẫu thử âm tính khi: Tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng. Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu kiểm chứng dương có kích thước 509 bp, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng.

7. Kết luận

...

...

...

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị môi trường, thuốc thử

A.1. Môi trường lỏng thioglycollat (FTM)

A.1.1. Thành phần

Môi trường FTM:                       29,3 g

Natri clorua:                              22 g

Nước cất:                                 1000 ml

...

...

...

Trộn 22 g natri clorua và 29,3 g FTM vào 1000 ml nước cất. Đun cho tan hoàn toàn đến khi dung dịch có màu vàng trong. Chia ra các ống nghiệm vô trùng, mỗi ống khoảng 9,5 ml.

Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (4.1.1) ở 115 °C trong 20 min.

Các ống nghiệm này được giữ nơi tối và bảo quản ở nhiệt độ 4 °C.

A.2. Dung dịch penicilin-streptomycin

A.2.1. Thành phần

Streptomycin sulfat (500 IU/ml):                         3,13 g

Penicilin G (500 IU/ml):                                       6,55 g

Nước khử ion:                                                  500 ml

A.2.2. Chuẩn bị

...

...

...

Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C.

A.3. Thuốc nhuộm Lugol iodine

A.3.1. Thành phần

Kali iodua:                    6g

I-ốt:                              4 g

Nước cất:                     100 ml

A.3.2. Chuẩn bị

Trộn 6 g Kali iodua và 4 g I-ốt vào 100 ml cho nước cất, lắc cho tan. Để yên trong 24 h sau đó được lọc qua giấy lọc.

Dung dịch được giữ trong chai màu nâu ở nhiệt độ phòng để tránh sự kết tủa. Dung dịch có thể được giữ trong nhiều tuần nhưng nên thỉnh thoảng lọc để loại bỏ các hạt kết tủa có thể xuất hiện.

...

...

...

A.4.1. Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X:            100 ml

Nước khử ion:                                      900 ml

Tổng:                                                    1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.4.2. Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Phụ lục 6

...

...

...

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy^® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) và protein K ủ qua đêm ở 56 °C như sau:

- Nhỏ 20 ml protein K vào ống ly tâm 1,5 ml;

- Chuyển 30 mg mẫu bệnh phẩm (6.2.3) vào ống ly tâm đã có protein K:

- Thêm 200 ml dung dịch AL (Lysis buffer);

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4);

- Ủ qua đêm ở 56 °C trong bể ủ nhiệt (4.2.5), sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4);

- Thêm 200 ml etanol tuyệt đối (3.2.1) vào ống ly tâm;

...

...

...

- Hút 420 ml huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g (8 000 r/min) trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thêm 500 ml dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g (8 000 r/min) trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thay ống thu ở dưới cột ly tâm;

- Thêm 500 ml dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 20 000 g (14 000 r/min) trong 3 min ở nhiệt độ phòng:

- Chuyển cột ly tâm sang ống eppendorf 1,5 ml;

- Nhỏ 200 ml dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

...

...

...

- Chuyển 200 ml ADN đã thu được sang ống eppendorf 1,5 ml khác.

Bảo quản ADN ở nhiệt độ từ 2°C đến 8 °C nếu thực hiện phản ứng PCR ngay hoặc ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C nếu thực hiện phản ứng PCR sau 24 h.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] FAO/NACA, Asia diagnostic guide to aquatic animal diseases. FAO Fish, Pap, No.402/2, 2001, M5. P 133-137

[2] Antonio Villalba, Kimberly S. Reece, M. Camino Ordás, Sandra M. Casas and Antonio Figueras, Perkinsosis in molluscs. Aquat. Living Resour, 2004,17. p 411-432

[3] Céline Garcia, Ricardo Leite, Isabelle Arzul, Parasites of the genus Perkinsus. Workshop for the analysis of the impact of Perkinsosis to the European shellfish industry session

[4] David Bushek, Susan E. Ford, and Standish K. Allen. Jr. Evaluation of methods using ray’s fluid thioglycollate medium for diagnosis of Perkinsus marinus infection in the eastern oyster, crassostrea virginica, Annual review of fish diseases, 1994, Vol 4. p 201-217

[5] Kenneedyt. Paynter, Vincent politano, Hillary A. Lane, Stevenm. Allen And donald meritt, Growth rates and prevalence of Perkinsus marinus prevalence in restored oyster population in Maryland - Journal of shellfish research, 2010, Vol 29. No2. p 309-317

...

...

...

[7] Nguyễn Thị Thu Hiền, Trần Thị Nguyệt Minh, Kết quả nghiên cứu một số tác nhân gây bệnh thường gặp trên ngao Meretrix sp tại vùng ven biển Hải Phòng, Bản tin Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I, Số 6 (Quý II năm 2012)

[8] Bùi Quang Tề, Bệnh do ngành bào tử Apicomplexa (Levine, 1978) Perkinsiosis, phần 3, Bệnh ký sinh trùng của động vật thủy sản, Bệnh học thủy sản, 2008, Trang 259-266

[9] Ngô Thị Thu Thảo, Một số đặc điểm của ký sinh trùng Perkinsus sp. lây nhiễm trên nghêu lụa Paphia undulata ở Kiên Giang và Bà Rịa - Vũng Tàu, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 2008, trang 222-230.

¹⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

²⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

³⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-10:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chuẩn đoán - Phần 10: Bệnh do Perkinsus Marinus ở nhuyễn thể hai mảnh nhỏ