Trong đó:

N: tổng số vi khuẩn trong 1 ml canh trùng.

C: số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa có nồng độ liền nhau.

V: thể tích (ml) cấy ở mỗi đĩa.

n₁: số đĩa của độ pha loãng ban đầu (2 đĩa).

n₂: số đĩa của độ pha loãng tiếp theo (2 đĩa).

d: độ pha loãng ban đầu.

- Pha canh trùng 2 x 10⁹ CFU/ml như sau:

Lấy số vi khuẩn đã tính được ở trên (N - theo công thức B.1) chia cho số vi khuẩn cần dùng (2 x 10⁹ CFU/mI) ta được một thông số (X). Sau đó ta lấy 1ml canh trùng nguyên ban đầu cộng với số ml (Y) nước muối sinh lý. Số ml của Y = X - 1 (điều kiện X ≥ 1), (B.2).

...

...

...

Lấy 3 x 10⁹ CFU/ml chia cho 2 x 10⁹ CFU/ml được thông số là 1,5. Để được canh trùng 2 x 10⁹ CFU/ml ta sẽ lấy 1 ml canh trùng 3 x 10⁹ CFU/ml và thêm vào 0,5 ml nước muối sinh lý. Hỗn dịch cuối cùng là canh trùng cần pha.

B.3.6  Chế huyết thanh tối miễn dịch

- Ngày thứ 1: tiêm 2 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ (5.2) theo đường dưới da.

- Ngày thứ 7: tiêm tiếp 0,2 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 11: tiêm tiếp 0,5 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 15: tiêm tiếp 1 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 19: tiêm tiếp 1,5 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 23: tiêm tiếp 2 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 27: tiêm tiếp 2,5 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

...

...

...

- Ngày thứ 35: tiêm tiếp 3,5 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 39: tiêm tiếp 4 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Một tuần sau mũi tiêm cuối cùng tiến hành lấy máu thỏ, chắt huyết thanh. Đó chính là huyết thanh tối miễn dịch.

B.4  Cách tiến hành

Quy trình cho phản ứng ngưng kết chậm với kháng nguyên thân (B.3.3) thực hiện trên đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U (B.2.9).

- Bố trí thí nghiệm.

+ Giếng thí nghiệm: A1 đến H8;

+ Giếng đối chứng âm: A9 đến H10;

+ Giếng đối chứng dương: A11 đến H12.

...

...

...

- Thực hiện thí nghiệm theo sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm như trên.

- Đối với các giếng thí nghiệm:

+ Dùng pipet đa kênh (B.2.5) hút 50 μl dung dịch PBS vào mỗi giếng thí nghiệm (A1 đến H8);

+ Dùng pipet đơn kênh (6.5) hút 50 μl huyết thanh (B.3.4) cho vào giếng đầu tiên và pha loãng theo cơ số 2 bằng cách trộn đều rồi chuyển 50 μl sang giếng thứ 2, cứ như vậy đến giếng số 8 trộn đều rồi hút bỏ đi 50 μl;

+ Dùng pipet đa kênh (B.2.5) hút 50 μl kháng nguyên thân (B.3.3) cho vào các giếng (A1 đến H8);

- Đối với các giếng đối chứng:

+ Đối chứng âm (A9 đến H10): Dùng pipet đơn kênh (6.5) hút 50 μl dung dịch PBS (B.1.6) và 50 μl kháng nguyên thân (B.3.3);

+ Đối chứng dương (A11 đến H12): Dùng pipet đơn kênh (6.5) hút 50 μl huyết thanh tối miễn dịch (B.3.6) và 50 μl kháng nguyên thân (B.3.3);

...

...

...

- Đọc kết quả:

+ Phản ứng âm tính: Kháng nguyên lắng tròn đáy giếng;

+ Phản ứng dương tính: Xảy ra phản ứng ngưng kết, kháng nguyên ngưng kết thành cụm lấm tấm đều ở đáy giếng;

+ Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết được đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Ví dụ phản ứng ELISA kiểm tra kháng thể Pasteurella multocida type A

C.1  Vật liệu thử

...

...

...

C.1.2  Nước cất 2 lần.

C.1.3  Bộ Kit ELISA.

C.2  Thiết bị và dụng cụ

C.2.1 Tủ ấm có thể duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0,5 °C.

C.2.2  Pipet đơn kênh, thể tích từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000 μl.

C.2.3  Pipet đa kênh, thể tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl.

C.2.4  Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 vòng/phút đến 2400 vòng/phút.

C.2.5  Máy đọc ELISA, có bước sóng 405 nm đến 650 nm.

C.3  Cách tiến hành

...

...

...

C.3.2  Nhỏ 50 μl đối chứng âm và 50 μl đối chứng dương vào các giếng đã định sẵn. Để trống 1 giếng làm giếng blank.

C.3.3  Nhỏ 50 μl mẫu đã được pha loãng thích hợp (độ pha loãng 1:5, ví dụ: 10 μl mẫu pha với 40 μl Samμle Diluent Buffer) vào các giếng có mẫu thử nghiệm. Gõ nhẹ vào đĩa (hoặc sử dụng máy lắc) để trộn.

C.3.4  Dán và ủ đĩa ở 37 °C trong 30 phút.

C.3.5  Tháo miếng dán và đổ bỏ dung dịch trong đĩa. Rửa đĩa 5 lần với dung dịch rửa 1X. Làm đầy vào từng giếng 300 μl bằng cách sử dụng pipet đa kênh (C.2.3) hoặc máy rửa tự động (khuyến cáo thời gian ngâm khoảng 1 đến 2 phút). Việc loại bỏ hoàn toàn chất lỏng ở mỗi bước là điều cần thiết để đạt được hiệu quả tốt. Sau lần rửa cuối cùng, loại bỏ phần còn lại bằng cách hút hoặc gạn. Lật ngược đĩa và thấm vào khăn giấy sạch thấm nước.

C.3.6  Nhỏ 50 μl dung dịch HRP conjugate reagent vào mỗi giếng (trừ giếng đối chứng).

C.3.7  Dán đĩa và ủ ở 37 °C trong 30 phút.

C.3.8  Tháo miếng dán, loại bỏ dung dịch và lặp lại bước (C.3.5).

C.3.9  Nhỏ 50 μl cơ chất A và 50 μl cơ chất B vào mỗi giếng. Gõ nhẹ đĩa để trộn đều. Dán đĩa và ủ ở 37 °C trong 10 phút. Tránh để đĩa tiếp xúc với ánh sáng.

C.3.10  Nhỏ 50 μl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng, nên trộn đều và nhanh để bất hoạt hoàn toàn hoạt tính của enzym.

...

...

...

C.4  Công thức tính kết quả

- Đối chứng dương trung bình (PCx) =

(C.1)

- Đối chứng âm trung binh (NCx) =

(C.2)

- OD mẫu trung bình (ODtb) =

...

...

...

Giá trị CUT OFF = Đối chứng âm (C.1) + 0,15.

C.5  Điều kiện kết quả

PCx (C.2) ≥ 1,0.

NCx (C.1) ≤ 0,10.

Nếu PCx ≥ 1,0, NCx ≤ 0,10, kết quả hợp lệ, nếu ngược lại thì kết quả không hợp lệ.

C.6  Diễn giải kết quả

Nếu OD mẫu (C.3) < CUT OFF, mẫu kiểm tra âm tính.

Nếu OD mẫu (C.3) ≥ CUT OFF, mẫu kiểm tra dương tính.

...

...

...

[1] ASEAN, (2018). Asean Standard Requirements for Swine Pasteurella multocida, Inactivated, p64-65.

[2] Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I, (2010). 12 VT - 10/KN1 - Quy trình kiểm nghiệm vắc xin Pasteurella multocida type A.

[3] Code of Federal Regualtions, (2021). 9 CFR 113.33: Mouse safety test, p691 ; 9 CFR 113.38: Guinea pig safety tests, p694.

[4] Hồ sơ vắc xin Biofors ARPM, p74-86.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-43:2023 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 43: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do Pasteurella multocida type A ở lợn