Bảng A.2 - Sơ đồ đĩa phản ứng bố trí mẫu đối chứng

Mẫu

Độ pha loãng

Đối chứng dương

Đối chứng âm

Đối chứng tế bào/Đối chứng môi trường

...

...

...

Dung dịch vi rút 10^-2

Dung dịch vi rút 10^-3

Dung dịch vi rút 10^-4

1

2

3

4

5

6

...

...

...

8

9

10

11

12

1/2

A

...

...

...

...

...

...

B

...

...

...

1/8

C

...

...

...

1/32

D

...

...

...

...

...

...

1/64

E

...

...

...

1/128

F

...

...

...

...

...

...

G

...

...

...

1/512

H

...

...

...

- Dùng pipet (6.6) cho 50 μl môi trường DMEM 1X vào các giếng A1 đến H12 của đĩa phản ứng.

- Dùng pipet (6.5) lần lượt cho 50 μl mẫu huyết thanh 01 vào giếng A1, A2.

...

...

...

- Dùng pipet (6.5) lần lượt cho 50 μl mẫu huyết thanh 03 vào giếng A5, A6.

- Dùng pipet (6.5) lần lượt cho 50 μl mẫu huyết thanh 04 vào giếng A7, A8.

- Dùng pipet (6.5) lần lượt cho 50 μl mẫu huyết thanh 05 vào giếng A9, A10.

- Dùng pipet (6.5) lần lượt cho 50 μl mẫu huyết thanh 06 vào giếng A11, A12.

- Dùng pipet (6.6) pha loãng bậc 2 mẫu huyết thanh từ A1 đến H1, từ A2 đến H2, từ A3 đến H3, A4 đến H4, A5 đến H5, A6 đến H6, A7 đến H7, A8 đến H8, A9 đến H9, A10 đến H10, A11 đến H11, A12 đến H12 và loại bỏ 50 μl.

- Dùng pipet (6.6) cho 50 μl dung dịch vi rút (A.3.3) vào tất cả các giếng từ A1 đến H12.

- Ủ đĩa ở tủ ấm (6.17) trong 45 min đến 60 min.

- Sau khi ủ xong, dùng pipet (6.6) cho 100 μl tế bào xơ phôi gà 1 lớp (A.1.8) vào tất cả các giếng.

- Ủ đĩa ở tủ ấm (6.17) trong 48 h đến 72 h.

...

...

...

A.3.4.2  Thực hiện trên đĩa đối chứng (Bảng A.2)

* Đối chứng huyết thanh

- Dùng pipet (6.6) cho 50 μl môi trường DMEM 1X vào giếng A1 đến H4.

- Dùng pipet (6.5) cho 50 μl huyết thanh đối chứng dương vào giếng A1 và A2 và cho 50 μl huyết thanh đối chứng âm vào giếng A3 và A4.

- Dùng pipet (6.6) pha loãng bậc 2 mẫu huyết thanh đối chứng từ A1 đến H1, từ A2 đến H2, từ A3 đến H3, A4 đến H4 và loại loại bỏ 50 μl.

* Đối chứng tế bào

- Dùng pipet (6.6) cho 100 μl môi trường DMEM 1X vào giếng A6 đến D6 và A7 đến D7.

- Ủ đĩa ở tủ ẩm CO₂ (6.17)trong 45 min đến 60 min.

* Đối chứng môi trường

...

...

...

- Ủ đĩa ở tủ ấm CO₂ (6.17) trong 45 min đến 60 min.

* Chuẩn độ lại vi rút sử dụng (A.3.3)

- Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng (A.3.3) thành nồng độ 10^-1 (100 μl dung dịch vi rút với 900 μl môi trường DMEM), tiếp tục pha loãng đến các nồng độ 10^-2, 10^-3 và 10^-4.

- Dùng pipet (6.5) cho 100 μl dung dịch vi rút pha loãng 10^-1 và các giếng từ A9 đến H9.

- Dùng pipet (6.5) cho 100 μl dung dịch vi rút pha loãng 10^-2 và các giếng từ A10 đến H10.

- Dùng pipet (6.5) cho 100 μl dung dịch vi rút pha loãng 10^-3 và các giếng từ A11 đến H11.

- Dùng pipet (6.5) cho 100 μl dung dịch vi rút pha loãng 10^-4 và các giếng từ A12 đến H12.

- Ủ đĩa ở tủ ấm CO₂ (6.17) trong 45 min đến 60 min.

- Sau khi ủ xong, dùng pipet (6.6) cho 100 μl tế bào xơ phôi gà 1 lớp (A.1.8) vào tất cả các giếng từ A1 đến H4, từ A6 đến D6, A7 đến D7 và từ A9 đến H12.

...

...

...

- Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược để ghi nhận bệnh tích tế bào.

A.3.5  Đọc kết quả

- Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới kính hiển vi soi ngược để ghi nhận bệnh lý tế bào trên từng giếng.

- Điều kiện chấp nhận kết quả:

+ Đối chứng tế bào: Bình thường;

+ Đối chứng môi trường: Bình thường;

+ Hiệu giá của mẫu đối chứng huyết thanh dương chuẩn chỉ chênh lệch ± 1 độ pha loãng bậc 2 so với hiệu giá đã biết.

- Kết quả dương tính là những giếng khi xem dưới kính hiển vi soi ngược không có bệnh tích tế bào (không có CPE).

- Kết quả âm tính là những giếng khi xem dưới kính hiển vi soi ngược có bệnh tích tế bào (có CPE).

...

...

...

Hiệu giá huyết thanh = a + 0,5 -1/n × Σr₁

Trong đó:

a là độ pha loãng cao nhất không có bệnh tích tế bào;

r₁ là số giếng có bệnh tích tế bào ở từng độ pha loãng;

n là số giếng sử dụng cho một độ pha loãng.

- Kết luận:

+ Mẫu có hiệu giá kháng thể trung hòa ≥ 1/32 được xem là mẫu dương tính;

+ Mẫu có hiệu giá kháng thể trung hòa <1/2 được xem là mẫu âm tính.

...

...

...

(tham khảo)

Ví dụ phương pháp ELISA kiểm tra kháng thể kháng ARV

B.1  Vật liệu thử

B.1.1  Huyết thanh gà cần kiểm tra.

B.1.2  Nước cất 2 lần.

B.1.3  Bộ Kit ELISA của hãng IDEXX (Avian Reovirus Antibody Test Kit)1).

B.2  Cách tiến hành

B.2.1  Pha loãng huyết thanh gà (B.1.1) bằng dung dịch pha mẫu theo tỷ lệ 1/500 (kí hiệu từ S1 đến S46).

B.2.2  Dùng pipet (6.5) nhỏ 100 μl đối chứng âm ARV vào giếng A1 và A2 của đĩa có phủ kháng nguyên ARV.

...

...

...

B.2.4  Dùng pipet (6.6) nhỏ 100 μl huyết thanh đã pha loãng (B.2.1) vào các giếng còn lại của đĩa có phủ kháng nguyên ARV, mỗi mẫu cho vào 2 giếng, (ví dụ mẫu S1 cho vào 2 giếng C1, C2, mẫu S2 cho vào 2 giếng D1, D2).

B.2.5  Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min (nhiệt độ từ 18 °C đến 25 °C).

B.2.6  Loại bỏ dung dịch trong giếng và rửa các giếng của đĩa bằng nước cất (B.1.2), mỗi giếng 350 μl nước cất, rửa từ 3 lần đến 5 lần, sau khi rửa xong vỗ đĩa vào giấy thấm cho khô nước.

B.2.7  Dùng pipet (6.6) nhỏ 100 μl kháng kháng thể (Kháng thể đã gắn enzym - Anti- chicken) vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, sau đó ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min (nhiệt độ từ 18 °C đến 25 °C).

B.2.8  Loại bỏ dung dịch trong giếng và rửa các giếng của đĩa bằng nước cất (B.1.2), dùng pipet (6.6) nhỏ mỗi giếng 350 μl nước cất, rửa từ 3 lần đến 5 lần, sau khi rửa xong vỗ đĩa vào giấy thấm cho khô nước.

B.2.9  Dùng pipet (6.6) nhỏ 100 μl cơ chất phù hợp với enzym vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, sau đó ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 min (nhiệt độ từ 18 °C đến 25 °C).

B.2.10  Dùng pipet (6.6) nhỏ 100 μl dung dịch dừng phản ứng vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, sau đó đặt đĩa vào máy đọc ELISA (6.10) và đọc ở bước sóng 650 nm để thu được các giá trị mật độ quang học (Optical density - OD) của các mẫu trong đĩa phản ứng.

Bảng B.1 - Sơ đồ bố trí mẫu trong đĩa ELISA

...

...

...

2

3

4

5

6

7

8

9

10

...

...

...

12

A

NC

NC

S7

S7

S15

S15

S23

...

...

...

S31

S31

S39

S39

B

PC

PC

S8

S8

...

...

...

S46

S24

S24

S32

S32

S40

S40

C

S1

...

...

...

S9

S9

S17

S17

S25

S25

S33

S33

S41

...

...

...

D

S2

S2

S10

S10

S18

S18

S26

S26

...

...

...

S34

S42

S42

E

S3

S3

S11

S11

S19

...

...

...

S27

S27

S35

S35

S43

S43

F

S4

S4

...

...

...

S12

S20

S20

S28

S28

S36

S36

S44

S44

...

...

...

S5

S5

S13

S13

S21

S21

S29

S29

S37

...

...

...

S45

S45

H

S6

S6

S14

S14

S22

S22

...

...

...

S30

S38

S38

S46

S46

CHÚ THÍCH:

NC: negative control (đối chứng âm)

PC: positive control (đối chứng dương)

S: samμle (mẫu)

...

...

...

B.3  Công thức tính kết quả

- Đối chứng dương trung bình: PCX =

- Đối chứng âm trung bình: NCx =

- OD mẫu trung bình: ODx =

- Giá trị s/p =

...

...

...

B.4  Điều kiện kết quả

Giá trị OD của đối chứng đạt điều kiện như sau thì phản ứng đạt:

- PCX – NCx > 0,075;

- NCx ≤ 0,150.

B.5  Diễn giải kết quả

+ Mẫu dương tính: S/P ≥ 0,20;

+ Mẫu âm tính: S/P < 0,20.

Thư mục tài liệu tham khảo

...

...

...

[2] Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I, (2010). 30VR - 10KN1 - Quy trình Kiểm nghiêm vắc xin phòng bệnh viêm khớp ở gia cầm (Avian Reovirus).

[3] R.C.Jones (2000). Avian reovirus infectious- Rev.sci.tech.Off.int.Epiz.,2000,1 9(2), p614-625.

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các bộ Kit ELISA được chỉ định khác nếu cho kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-41:2023 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 41: Vắc xin phòng bệnh viêm khớp do avian reovirus ở gà