Hình A.1 - Minh họa đĩa nhựa 96 giếng

- Thực hiện trên đĩa phản ứng 96 giếng (A.2.8) theo các bước sau:

Bước 1: dùng micropipet (A.2.13) nhỏ 150 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào các giếng A1, A3, A5, A7, A9 và A11 của đĩa phản ứng.

Bước 2: dùng micropipet (A.2.13) nhỏ 100 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào các giếng từ B1 đến H1, từ B3 đến H3, từ B5 đến H5, tử B7 đến H7, từ B9 đến H9 và từ B11.đến H11.

Bước 3: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl mẫu huyết thanh cần Kiểm tra (6.4.1) vào các giếng A1, A3, A5, A7, A9, A11.

Bước 4: pha loãng bậc 2 mẫu huyết thanh từ A1 đến H1, từ A3 đến H3, từ A5 đến H5, từ A7 đến H7, từ A9 đến H9 và từ A11 đến H11 và loại bỏ 100 μl.

Bước 5: dùng micropipet (A.2.14) chuyển 50 μl mẫu huyết thanh đã pha loãng ở bước 4 từ cột 1 sang cột 2, từ cột 3 sang cột 4, từ cột 5 sang cột 6, từ cột 7 sang cột 8, từ cột 9 sang cột 10 và từ cột 11 sang cột 12.

Bước 5: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl dung dịch vi rút (A.3.2) vào các giếng.

Bảng A.1 - Sơ đồ bố trí mẫu trên đĩa phản ứng 96 giếng

...

...

...

Độ pha loãng

Mẫu huyết thanh 01

Mẫu huyết thanh 02

Mẫu huyết thanh 03

Mẫu huyết thanh 04

Mẫu huyết thanh 05

Mẫu huyết thanh 06

1

...

...

...

3

4

5

6

7

8

9

10

11

...

...

...

A

...

...

...

1/4

B

...

...

...

1/8

...

...

...

...

...

...

1/32

D

...

...

...

1/64

E

...

...

...

...

...

...

1/128

F

...

...

...

1/256

G

...

...

...

1/512

...

...

...

...

...

...

Bước 6: ủ đĩa ở tủ ấm C02 (A.2.9) trong 45 phút đến 60 phút.

Bước 7: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl môi trường DMEM chứa tế bào xơ phôi gà 1 lớp (A.3.1.3) vào tất cả các giếng.

Bước 7: ủ đĩa ở tủ ấm C02 (A.2.9) trong 48 giờ đến 72 giờ.

Bước 8: kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi (A.2.6) ở vật kính 10 × để xem tế bào có ảnh hưởng bởi độc tố không (tế bào chết nhiều).

A.3.4  Thực hiện trên đĩa đối chứng

Chuẩn bị 1 đĩa phản ứng 96 giếng (A.2.8) làm đĩa đối chứng, sơ đồ bố trí mẫu đối chứng trên đĩa phản ứng 96 giếng được nêu ở bảng A.2.

Bảng A.2 - Sơ đồ bố trí mẫu đối chứng trên đĩa phản ứng 96 giếng

...

...

...

Độ pha loãng

Đối chứng huyết thanh

Đối chứng tế bào

Đối chứng môi trường

Dung dịch vi rút 10^-1

...

...

...

Dung dịch vi rút 10^-3

Dung dịch vi rút 10^-4

1

2

3

4

5

6

7

...

...

...

9

10

11

12

A

...

...

...

1/4

...

...

...

...

...

...

1/8

C

...

...

...

1/32

D

...

...

...

...

...

...

1/64

E

...

...

...

1/128

F

...

...

...

1/256

...

...

...

...

...

...

1/512

H

...

...

...

A.3.4.1  Đối chứng huyết thanh

Bước 1: dùng micropipet (A.2.13) nhỏ 150 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào giếng A1 của đĩa phản ứng 96 giếng (A.2.8).

Bước 2: dùng micropipet (A.2.13) nhỏ 100 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào các giếng từ giếng B1 đến giếng H1 của đĩa phản ứng.

...

...

...

Bước 4: dùng micropipet (A.2.14) chuyển 50 μl mẫu huyết thanh đã pha loãng từ cột 1 sang cột 2 của đĩa phản ứng.

Bước 5: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl dung dịch vi rút (A.3.2) vào các giếng từ giếng A1 đến giếng H2 của đĩa phản ứng.

A.3.4.2  Đối chứng tế bào

Dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào các từ giếng A3 đến giếng H4 của đĩa phản ứng.

A.3.4.3  Đối chứng môi trường

Dùng micropipet (A.2.13) nhỏ 150 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào giếng A6 đến H7.

A.3.4.4  Chuẩn độ lại vi rút sử dụng

- Bước 1: pha loãng dung dịch vi rút (A.3.2) thành nồng độ 10^-1 (100 μl dung dịch vi rút với 900 μl môi trường DMEM), tiếp tục pha loãng đến các nồng độ 10^-2, 10^-3 và 10^-4.

- Bước 2: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào các giếng từ A9 đến H12.

...

...

...

- Bước 4: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl dung dịch vi rút pha loãng ở nồng độ 10^-2 vào các giếng từ A10 đến H10.

- Bước 5: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl dung dịch vi rút pha loãng ở nồng độ 10^-3 vào các giếng từ A11 đến H11.

- Bước 6: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl dung dịch vi rút pha loãng ở nồng độ 10^-4 vào các giếng từ A12 đến H12.

- Bước 7: ủ đĩa ở tủ ấm C02 (A.2.9) trong 45 phút đến 60 phút.

- Bước 8: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl môi trường DMEM chứa tế bào xơ phôi gà 1 lớp (A.3.1.3) vào tất cả các giếng từ A1 đến H2, từ A3 đến H4 và từ A9 đến H12.

A.3.4.5  Ủ đĩa

Ủ đĩa ở tủ ấm CO₂ (A.2.9) trong 24 giờ đến 48 giờ.

A.3.4.6  Soi kính kiểm tra tế bào

Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi (A.2.6) ở vật kính 10 X để xem tế bào có ảnh hưởng bởi độc tố không (tế bào chết nhiều).

...

...

...

- Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới kính hiển vi soi ngược (A.2.6) để ghi nhận bệnh lý tế bào trên từng giếng.

- Điều kiện chấp nhận kết quả:

+ Đối chứng tế bào: bình thường;

+ Đối chứng môi trường: bình thường;

+ Hiệu giá của mẫu đối chứng huyết thanh dương chuẩn chỉ chênh lệch ± 1 độ pha loãng bậc 2 so với hiệu giá đã biết;

+ Hiệu giá chuẩn độ lại của vi rút 100 TCID₅₀ nằm trong khoảng log₁₀ 1,5 đến log₁₀ 2,5.

- Kết quả dương tính là những giếng khi xem dưới kính hiển vi (A.2.6) không có bệnh tích tế bào (không có CPE).

- Kết quả âm tính là những giếng khi xem dưới kính hiển vi (A.2.6) có bệnh tích tế bào (có CPE).

- Bệnh tích tế bào được ghi nhận vào phiếu kết quả. Kết quả được tính bằng công thức Karber (1931).

...

...

...

Trong đó:

a  là độ pha loãng cao nhất không có bệnh tích tế bào;

r_l  là số giếng có bệnh tích tế bào ở từng độ pha loãng huyết thanh;

n là số giếng sử dụng cho một độ pha loãng huyết thanh.

Phụ lục B

(Quy định)

Chuẩn độ hàm lượng vi rút vắc xin

B.1  Vật liệu và thuốc thử

...

...

...

B.1.2  Dung dịch PBS 1 X, pH 7,2.

B.1.3  Dung dịch trypsin 1 X.

B.1.4  Huyết thanh bào thai bê (FBS).

B.1.5  Môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM có bổ sung 5 % đến 10 % huyết thanh bào thai bê

B.1.6  Huyễn dịch vi rút Marek.

B.1.7  Dung dịch pha loãng vi rút DMEM 1 X (dung dịch A).

B.1.8  Dung dịch DMEM 1X có bổ sung 2 % FBS, kháng sinh kháng nấm (dung dịch B).

B.1.9  Dung dịch DMEM 2X có bổ sung 2 % FBS, kháng sinh kháng nấm (dung dịch C).

B.1.10  Agar 1 % trong dung dịch DMEM có bổ sung 2 % FBS (dung dịch D).

...

...

...

B.2  Thiết bị, dụng cụ

B.2.1  Panh, kéo nhọn vô trùng.

B.2.2  Đĩa lồng (đĩa petri) vô trùng.

B.2.3  Bình tam giác, cốc đong vô trùng.

B.2.4  Máy khuấy từ, tốc độ từ 5 vòng/phút đến 200 vòng/phút.

B.2.5  Máy ly tâm, có thể quay với tốc độ 1500 vòng/phút.

B.2.6  Kính hiển vi có vật kính với độ phóng đại 10 X.

B.2.7  Đĩa phản ứng 6 giếng sạch.

B.2.8  Đĩa phản ứng 96 giếng sạch.

...

...

...

B.2.10  Bơm tiêm một lần, dung tích 5 ml, 10 ml.

B.2.11  Buồng đếm tế bào Neubauer Improved

B.2.12  Tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

B.2.13  Micropipet, dung tích từ 100 μl đến 1000 μl.

B.2.14  Micropipet, dung tích từ 50 μl đến 100 μl.

B.2.15  Ống eppendorf, dung tích 100 μl đến 1000 μl.

B.2.16  Pipet, dung tích từ 0,5 ml đến 5 ml.

B.3  Cách tiến hành

B.3.1  Chuẩn bị tế bào có mật độ 3 x 10⁵ tế bào/ml

...

...

...

- Bước 1: dùng panh (B.2.1) đập lớp vỏ của trứng gà có phôi (B.1.1) ở phía buồng hơi và bộc lộ màng cứng. Lấy panh (B.2.1) gắp phôi ra ngoài, tập trung phôi vào cốc đong (B.2.3).

- Bước 2: rửa phôi từ 2 lần đến 3 lần bằng dung dịch PBS (B.1.2).

- Bước 3: gắp phôi ra đĩa lồng (B.2.2). Dùng kéo nhọn (B.2.1) loại bỏ chân, cánh, đầu, cơ quan nội tạng.

- Bước 4: rửa phôi đã cắt từ 2 lần đến 3 lần bằng dung dịch PBS (B.1.2) với lượng 10 ml/ phôi/ lần rửa.

- Bước 5: dùng kéo nhọn (B.2.1) cắt nhỏ phôi và chuyển vào bình tam giác (B.2.3).

- Bước 6: dùng bơm tiêm một lần (B.2.10) hút dung dịch PBS (B.1.2) vào bình tam giác chứa phôi đã được cắt nhỏ với lượng 10 ml/ phôi. Đặt bình tam giác trên máy khuấy từ (B.2.4) để rửa phôi trong vòng 10 phút. Sau đó để lắng, dùng bơm tiêm một lần (B.2.10) hút bỏ dịch nổi ở trên, chỉ giữ lại cặn.

B.3.1.2  Trypsin hóa tách tế bào

- Bước 1: dùng bơm tiêm một lần (B.2.10) hút dung dịch trypsin (B.1.3) vào bình tam giác chứa phôi đã được bộc lộ (B.3.1.1) với lượng 5 ml/ phôi.

- Bước 2: giữ bình trypsin ở nhiệt độ 37 °C trong khoảng 15 phút đến 20 phút.

...

...

...

- Bước 4: bổ sung 2 % huyết thanh bào thai bê FBS (B.1.4) so với lượng trypsin đã dùng để trung hòa dung dịch, cuối cùng ta thu được tế bào đã được trypsin hóa.

B.3.1.3  Loại bỏ trypsin

Ly tâm tế bào sau khi trypsin hóa bằng máy ly tâm (B.2.5) với tốc độ 1500 vòng/phút, trong 15 phút ở nhiệt độ 4 °C. Dùng bơm tiêm một lần (B.2.10) hút bỏ dịch nổi phía trên, thu được cặn tế bào.

B.3.1.4  Cân bằng môi trường và đếm số tế bào

- Dùng bơm tiêm một lần (B.2.10) hút 6 ml môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (B.1.5) cho từ từ vào bình tam giác chứa cặn tế bào đã được loại bỏ trypsin (B.3.1.3).

- Pha loãng tế bào 10 lần (ví dụ 100 μl tế bào với 900 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (B.1.5)), dùng buồng đếm tế bào (B.2.11) để đếm số tế bào trên kính hiển vi (B.2.6) ở vật kính 10 X, tính số tế bào có trong 1 ml theo công thức sau:

B.3.1.5  Cấy chuyển tế bào

- Pha loãng tế bào đến 3 × 10⁶ tế bào/ ml trong môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (B.1.5) vừa đủ thể tích cần nuôi cấy.

...

...

...

+ Thể tích môi trường nuôi cấy tế bào của mỗi đĩa phản ứng 6 giếng là 10 ml, nên số lượng tế bào cần sử dụng là 10 × 3 × 10⁵ tế bào.

+ Thể tích tế bào cần sử dụng = (10 x 3 x 10⁵)/số tế bào (tính theo công thức trong mục A.3.1.4)

+ Thể tích môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM = 10 ml - thể tích tế bào cần sử dụng.

+ Trộn đều thể tích tế bào cần sử dụng và môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM.

- Chuyển 1,6 ml huyễn dịch tế bào vào các giếng của đĩa phản ứng 6 giếng (B.2.7).

B.3.1.6  Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển

Giữ huyễn dịch tế bào (B.3.1.5) ở tủ ấm CO₂ (B.2.9) theo dõi sự phát triển của tế bào trong 1 ngày đến 2 ngày, khi tế bào bám đáy 100 % tiến hành chuẩn độ vi rút trên tế bào.

B.3.2  Chuẩn độ vi rút trên tế bào

B.3.2.1  Pha loãng vi rút

...

...

...

- Bước 2: dùng micropipet (B.2.14) chuyển 100 μl huyễn dịch vi rút Marek (B.1.6) vào ống 1, trộn đều.

- Bước 3: dùng micropipet (B.2.14) lần lượt chuyển 100 μl huyễn dịch vi rút từ ống 1 sang ống 2, thực hiện lần lượt cho đến ống 10 ta được huyễn dịch vi rút pha loãng từ 10^-1 đến 10^-10.

B.3.2.2  Gây nhiễm vi rút trên đĩa phản ứng 6 giếng

- Bước 1: loại bỏ môi trường trên đĩa phản ứng 6 giếng (B.3.1.5).

- Bước 2: dùng micropipet (B.2.14) nhỏ huyễn dịch vi rút pha loãng (B.3.2.1) vào các giếng của đĩa phản ứng 6 giếng ở các nồng độ pha loãng từ 10^-1 đến 10^-10, mỗi giếng 1 ml.

- Bước 3: gây nhiễm vi rút ở các nồng độ pha loãng từ 10^-1 đến 10^-10, mỗi giếng 1 ml, giếng đối chứng tế bào cho 1 ml dung dịch A.

- Bước 4: ủ đĩa ở tủ ấm CO₂ (B.2.9) trong 1 giờ.

- Bước 5: loại bỏ môi trường gây nhiễm vi rút trên đĩa phản ứng 6 giếng.

- Bước 6: dùng pipet (B.2.16) cho dung dịch A (B.1.7) vào tất cả các giếng, mỗi giếng 2 ml.

...

...

...

- Bước 1: dùng pipet (B.2.16) cho dung dịch D (B.1.10) vào tất cả các giếng, mỗi giếng 2 ml.

- Bước 2: để đĩa ở nhiệt độ phòng 15 phút đến 20 phút cho đông thạch. Lật ngược đĩa phản ứng 6 giếng.

- Bước 3: ủ đĩa ở tủ ấm CO₂ (B.2.9) trong 2 ngày đến 4 ngày.

B.3.2.4  Cố định tế bào

- Bước 1: dùng micropipet (B.2.14) nhỏ dung dịch C (B.1.9) vào các giếng của đĩa phản ứng 6 giếng, mỗi giếng 100 μl.

- Bước 2: để đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.

B.3.2.5  Nhuộm tế bào

- Bước 1: dùng pipet (B.2.16) cho dung dịch E (B.1.11) vào các giếng của dĩa phản ứng 6 giếng, mỗi giếng 2 ml.

- Bước 2: để đĩa ở nhiệt độ phòng trên 12 giờ.

...

...

...

B.3.2.6  Đọc kết quả

- Các giếng dương tính: tế bào bị phá hủy để lại khoảng trống trắng ở giếng (Plaque).

- Các giếng âm tính: tế bào không bị phá hủy bắt màu tím violet.

- Tính số lượng đơn vị mảng bám (PFU/1 ml) theo công thức sau:

X = A x 1/n x B

Trong đó:

X: đơn vị mảng bám (PFU)

A: số mảng bám ở nồng độ pha loãng cao nhất

B: độ pha loãng vi rút cao nhất mà vẫn còn mảng bám

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] ASEAN, (2012). Asean Standard Requirements for Marek’s Disease Vaccine, live. 2nd edition, p28 - 29.

[2] OIE Terrestrial Manual (2012). Chapter 2.3.13 Marek's disease. Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.

[3] Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I, (2010). TCCS 16VR-10KN1 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin Marek nhược độc.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-37:2020 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 37: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Marek ở gà