- Dùng micropipet (A.2.4) nhỏ 50 μl môi trường nuôi cấy tế bào MEM có 10 μg/ ml Trypsin (A. 1.3) vào tất cả các giếng.

- Ủ đĩa ở tủ ấm CO₂ (6.1) trong 1 giờ.

- Dùng micropipet (A.2.4) nhỏ 100 μl tế bào Vero (A.1.1) vào tất cả các giếng từ dãy 1 đến dãy 11 (trừ dãy 12).

- Ủ đĩa ở tủ ấm CO₂ (6.1) trong 48 giờ.

- Kiểm tra tế bào hàng ngày dưới kính hiển vi (6.2) ở vật kính 10 X và ghi nhận bệnh tích tế bào. Với các đám tế bào bị dung giải màng, nhân tế bào co cụm lại với nhau hình thành các thể hợp bào.

A.3  Đọc kết quả

Ghi nhận bệnh tích tế bào và tính liều gây nhiễm 50 % tế bào TCID₅₀/ml bằng công thức Karber (1931).

TCID₅₀ = x +0,5 - Σr_i/n

Trong đó: x: độ pha loãng cao nhất có ít nhất 1 giếng có bệnh tích tế bào

...

...

...

n: số giếng sử dụng cho 1 độ pha loãng

Phụ lục B

(Tham khảo)

Ví dụ về phản ứng ELISA sử dụng KIT thương mại

B.1  Nguyên vật liệu

B.1.1  Huyết thanh lợn cần kiểm tra (xem 7.5.1).

B.1.2  Nước cất đã khử ion.

B.1.3  Bộ kit PED Ab hãng BIOVET INC (Porcine Epidemic Diarrhea Virus Antibody Test Kit, Swinecheck^® PED indirect - 5 plates Insert).

...

...

...

B.2.1  Tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

B.2.2  Micropipet, dung tích từ 100 μl đến 1000 μl.

B.2.3  Micropipet, dung tích từ 50 μl đến 100 μl.

B.3  Chuẩn bị

B.3.1  Chuẩn bị dung dịch rửa 1 X

Lắc đều dung dịch rửa đậm đặc 10 X, sau đó pha loãng với nước cất (B.1.2) theo tỷ lệ 1/10 (ví dụ, 100 ml dung dịch rửa đậm đặc 10 X với 900 ml nước cất).

B.3.2 Chuẩn bị chất pha loãng mẫu 1 X

Lắc đều dung dịch pha loãng mẫu đậm đặc 5 X, sau đó pha loãng với nước cất (B.1.2) theo tỷ lệ 1/5 (ví dụ, 10 ml dung dịch pha loãng mẫu đậm đặc 5 X với 40 ml nước cất).

B.3.3  Chuẩn bị mẫu huyết thanh

...

...

...

B.4  Cách tiến hành

Trước khi tiến hành phản ứng, toàn bộ hóa chất của KIT ELISA cần được để ở nhiệt độ phòng và lắc kỹ trước khi sử dụng. Phức hợp enzyme sau khi sử dụng xong cần được bảo quản lại ở tủ lạnh (B.2.1).

- Dùng micropipet (B.2.2) nhỏ 100 μl đối chứng âm PED vào giếng A1 và A2 của đĩa có phủ kháng nguyên PEDV.

- Dùng micropipet (B.2.2) nhỏ 100 μl đối chứng dương PED vào giếng B1 và B2 của đĩa có phủ kháng nguyên PEDV.

- Dùng micropipet (B.2.3) nhỏ 100 μl mẫu huyết thanh đã pha loãng (B.3.3) vào các giếng còn lại (trừ giếng A1, A2, B1, B2) của đĩa có phủ kháng nguyên PEDV.

- Đậy kín các giếng và ủ ở nhiệt độ 23 °C ± 2 °C trong 1 giờ.

- Rửa mỗi giếng 4 lần, mỗi lần 300 μl dung dịch rửa 1 X (B.3.1). Bỏ đi tất cả dung dịch chứa trong đĩa sau mỗi lần rửa.

- Dùng micropipet (B.2.3) nhỏ 100 μl phức hợp enzyme A vào mỗi giếng.

- Đậy kín các giếng và ủ ở nhiệt độ 23 °C ± 2 °C trong 1 giờ.

...

...

...

- Dùng micropipet (B.2.3) nhỏ 100 μl phức hợp enzyme B vào mỗi giếng.

- Đậy kín các giếng và ủ ở nhiệt độ 23 °C ± 2 °C trong 1 giờ.

- Rửa mỗi giếng 4 lần với 300 μl dung dịch rửa 1 X (B.3.1). Bỏ đi tất cả dung dịch chứa trong đĩa sau mỗi lần rửa.

- Dùng micropipet (B.2.3) nhỏ 100 μl cơ chất vào mỗi giếng.

- Đậy kín các giếng và ủ ở nhiệt độ 23 °C ± 2 °C trong 10 phút, tránh ánh sáng.

- Dùng micropipet (B.2.3) nhỏ 100 μl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng.

- Dùng micropipet (B.2.3) nhỏ dung dịch dừng phản ứng vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, mỗi giếng 100 μl, sau đó đặt đĩa vào máy đọc ELISA (6.3) ở bước sóng 450 nm để thu được các giá trị mật độ quang (Optical density - OD) của các mẫu trong đĩa phản ứng.

Bảng B.1 - Sơ đồ bố trí mẫu trong đĩa ELISA

...

...

...

2

3

4

5

6

7

8

9

10

...

...

...

12

A

NC

NC

S7

S7

S15

S15

S23

...

...

...

S31

S31

S39

S39

B

PC

PC

S8

S8

...

...

...

S16

S24

S24

S32

S32

S40

S40

C

S1

...

...

...

S9

S9

S17

S17

S25

S25

S33

S33

S41

...

...

...

D

S2

S2

S10

S10

S18

S18

S26

S26

...

...

...

S34

S42

S42

E

S3

S3

S11

S11

S19

...

...

...

S27

S27

S35

S35

S43

S43

F

S4

S4

...

...

...

S12

S20

S20

S28

S28

S36

S36

S44

S44

...

...

...

S5

S5

S13

S13

S21

S21

S29

S29

S37

...

...

...

S45

S45

H

S6

S6

S14

S14

S22

S22

...

...

...

S30

S38

S38

S46

S46

CHÚ THÍCH:

NC: negative control (đối chứng âm)

PC: positive control (đối chứng dương)

S: sample (mẫu kiểm tra)

...

...

...

- Phản ứng được công nhận khi:

+ mật độ quang (OD) của đối chứng âm < 0,4;

+ mật độ quang (OD) của đối chứng dương - mật độ quang (OD) của đối chứng âm ≥ 0,7.

- Đánh giá kết quả dựa trên tỷ lệ S/P (tỷ lệ mẫu/mẫu dương tính):

Mẫu dương tính:

S/P ≥ 0,4;

Mẫu âm tính:

S/P < 0,4.

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] EMA, (2017). VICH GL50 on Harmonisation of criteria to waive target animal batch safety testing for inactivated vaccines for veterinary use.

[2] EMA, (2017). VICH GL55 on Harmonisation of criteria to waive target animal batch safety testing for live vaccines for veterinary use.

[3] Nisseiken, (2018). Proposal on potency assay method of Nisseiken PED Live Vaccine.

[4] Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I, (2010). 21VR-10KN1 : Quy trình Kiểm nghiệm vắc xin PED.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-34:2020 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 34: Vắc xin phòng bệnh tiêu chảy thành dịch do Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) gây ra ở lợn