Phụ lục B

(Quy định)

Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI)

B.1  Chuẩn độ kháng nguyên 4 đơn vị HA

B1.1  Kháng nguyên được pha 4 đơn vị HA cần phải chuẩn để phản ứng HI cho kết quả chính xác. Ví dụ: HA bằng 1/256, 4 HA bằng 1/64 (Pha 4 HA: gồm 1 phần kháng nguyên và 63 phần nước muối sinh lý).

B1.2  Kiểm tra kháng nguyên 4 HA đã pha: tiến hành phản ứng HA (xem phụ lục A), nếu kết quả ngưng kết đến giếng thứ 2, như vậy kháng nguyên pha đạt. Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 (hoặc hơn) là kháng nguyên pha đặc. Nếu ngưng kết chỉ ở giếng đầu tiên là kháng nguyên pha loãng.

B.2  Chuẩn bị huyết thanh kiểm tra

Lấy máu động vật (7.6.2.1), chắt lấy huyết thanh. Sau đó khử bổ thể bằng cách đun ở nồi đun cách thủy (6.8) ở nhiệt độ 56 °C trong 30 min.

...

...

...

B.3.1  Sử dụng Micropipet (6.10) nhỏ 25 μl nước muối sinh lý (5.3) vào đĩa nhựa 96 giếng chữ V (6.12).

B.3.2  Dùng Micropipet (6.10) nhỏ 25 μl huyết thanh cần kiểm tra (B.2) vào giếng 1.

B.3.3  Pha loãng huyết thanh: sử dụng Micropipet (6.10) trộn đều huyết thanh với nước muối sinh lý ở giếng 1, rồi hút 25 μl chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 25 μl chuyển sang giếng 3 trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng 11 rồi bỏ đi 25 μl.

B.3.4  Sử dụng Micropipet (6.10) nhỏ 25 μl dung dịch kháng nguyên 4 HA vào các giếng từ 1 đến 11. Lắc nhẹ, để 30 min ở nhiệt độ phòng.

B.3.5  Giếng 12 làm đối chứng hồng cầu: 50 μl nước muối sinh lý (5.2) và 50 μl hồng cầu gà 1 % (A.3.3).

B.3.6  Sử dụng Micropipet (6.10) nhỏ 25 μl hồng cầu gà 1 % (A.3.3) vào các giếng của đĩa phản ứng. B.2.7 Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy. ù đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng 30 min, đọc kết quả.

B.3  Đọc kết quả

- Phản ứng âm tính: có hạt ngưng kết lấm tấm.

- Phản ứng dương tính: hồng cầu lắng xuống đáy tạo chấm tròn.

...

...

...

Các bước

Nguyên liệu

Giếng

1

2

3

4

5

6

...

...

...

8

9

10

11

12

Pha loãng huyết thanh

Nước muối sinh lý, μl

25

25

...

...

...

25

25

25

25

25

25

25

25

25

...

...

...

25

Chuyển 25 μl từ giếng 1 sang giếng 2, trộn đều, chuyển tiếp tục đến giếng 11 rồi hút bỏ 25 μl

0

Cho kháng nguyên

Kháng nguyên 4 HA, μl

25

25

25

25

...

...

...

25

25

25

25

25

25

0

Lắc nhẹ, để 30 min ở nhiệt độ phòng

...

...

...

25

25

25

25

25

25

25

25

25

...

...

...

25

25

Độ pha loãng kháng thể

...

...

...

-

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phản ứng ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

...

...

...

- Huyết thanh gà cần kiểm tra

- Nước cất 2 lần

- Kit ELISA phát hiện kháng thể Mycoplasma gallisepticum

VÍ DỤ: Dùng Kit ELISA của hãng IDEXX ( Mycoplasma gallisepticum Antibody Test Kit ,)[1].

C.2  Cách tiến hành

C.2.1  Pha loãng huyết thanh bằng dung dịch pha mẫu theo tỷ lệ 1/500.

C.2.2  Cho 100 μl đối chứng dương vào giếng A1 và A2 của đĩa có phủ kháng nguyên Mycoplasma gallisepticum.

C.2.3  Cho 100 μl đối chứng âm vào giếng B1 và B2 của đĩa có phủ kháng nguyên Mycoplasma gallisepticum.

C.2.4  Cho huyết thanh đã pha loãng (A.2.1) vào các giếng còn lại (từ giếng A5 đến giếng H12) của đĩa có phủ kháng nguyên Mycoplasma gallisepticum.

...

...

...

C.2.6  Loại bỏ dung dịch trong đĩa, rửa các giếng của đĩa bằng nước cất 2 lần, mỗi giếng 350 μl nước cất, rửa từ 3 lần đến 5 lần, sau khi rửa xong vỗ đĩa vào giấy thấm cho khô nước.

C.2.7  Cho Conjugate Solution vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, mỗi giếng 100 μl, sau đó ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min (nhiệt độ từ 18 °C đến 25 °C).

C.2.8  Loại bỏ dung dịch trong đĩa, rửa các giếng của dĩa bằng nước cất 2 lần, mỗi giếng 350 μl nước cất, rửa từ 3 lần đến 5 lần, sau khi rửa xong vỗ đĩa vào giấy thẩm cho khô nước.

C.2.9  Cho TMB substrate vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, mỗi giếng 100 μl, sau đó ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 min (nhiệt độ từ 18 °C đến 25 °C).

C.2.10  Cho Stop Solution vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, mỗi giếng 100 μl, sau đó đặt đĩa vào máy đọc ELISA (6.7) ở bước sóng 650 nm để ra các giá trị Optical Density (OD) của các mẫu trong đĩa phản ứng.

Bảng C.1 - Sơ đồ vị trí mẫu trong đĩa ELISA

1

2

...

...

...

4

5

6

7

8

9

10

11

12

...

...

...

NC

NC

S7

S7

S15

S15

S23

S23

S31

...

...

...

S39

S39

B

PC

PC

S8

S8

S16

S16

...

...

...

S24

S32

S32

S40

S40

C

S1

S1

S9

...

...

...

S17

S17

S25

S25

S33

S33

S41

S41

D

...

...

...

S2

S10

S10

S18

S18

S26

S26

S34

S34

...

...

...

S42

E

S3

S3

S11

S11

S19

S19

S27

...

...

...

S35

S35

S43

S43

F

S4

S4

S12

S12

...

...

...

S20

S28

S28

S36

S36

S44

S44

G

S5

...

...

...

S13

S13

S21

S21

S29

S29

S37

S37

S45

...

...

...

H

S6

S6

S14

S14

S22

S22

S30

S30

...

...

...

S38

S46

S46

CHÚ THÍCH:

NC (negative control): đối chứng âm;

PC (positive control): đối chứng dương;

S (sample): mẫu.

C.3  Công thức tính kết quả

- Đối chứng dương trung bình (PCx) =

...

...

...

- Giá trị S/P =

- Hiệu giá S/P (ở độ pha loãng 1 : 500): log₁₀ Titer = 1,09 (log₁₀S/P) + 3,36

C.4  Điều kiện kết quả

Giá trị OD của đối chứng đạt điều kiện như sau thì phản ứng đạt

- OD đối chứng dương - OD đối chứng âm > 0,075 (PCx - NCx > 0,075)

- OD đối chứng âm < 0,150 (NCx ≤ 0,150)

C.5  Diễn giải kết quả

- Giá trị S/P < 0,50 mẫu kiểm tra âm tính (S/P < 0,50 : N)

- Giá trị S/P > 0,50 mẫu kiểm tra dương tính (S/P > 0,50 : P).

...

...

...

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp nhuộm Dien’s stain

D.1  Chuẩn bị môi trường hóa chất

D.1.1  Môi trường Diene

D. 1.1.1  Xanh methylen 2,5 mg

D.1.1.2  Azure 1,25 mg

D. 1.1.3  Maltose 10 mg

D. 1.1.4  Natri cacbonat (Na2CO3) 0,25 mg

...

...

...

Dung dịch xử lý vết bẩn của Diene được chuẩn bị bằng cách pha loãng một phần dung dịch gốc 1 : 3 với nước cất.

D.1.2  Ethanol 95 %

D.2  Cách tiến hành

D.2.1  Làm ngập môi trường chứa thạch Mycoplasma gallisepticum trong 1 ml Diene (D.1.1)

D.2.2  Rửa ngay lập tức bề mặt thạch bằng nước cất

D.2.3  Làm mất màu môi trường bằng cách thêm 1 ml ethanol 95 % (D.1.2) trong 1 min và rửa bằng nước cất.

D.2.4  Rửa sạch môi trường bằng nước cất và để khô.

D.2.5  Quan sát dưới kính hiển vi (6.17).

D.3  Đọc kết quả:

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCCS 17VT- 2015/KNI : Quy trình kiểm nghiệm vắc xin Mycolasma Gallisepticum

[2] ASEAN Standards for Animal Vaccine: Asean standard Requirements for Mycolasma Gallisepticum Bacterin.

[3] OIE Terrestrial Manual 2008- Chapter 2.3.5 Avian Mycoplasmosis.

[1] Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-32:2019 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 32: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Mycoplasma gallisepticum ở gia cầm