3.2. Chuẩn bị động vật thí nghiệm

11 con lợn khỏe mạnh từ 3 đến 4 tuần tuổi, âm tính với kháng thể kháng vi rút hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản.

4. Cách tiến hành

4.1. Kiểm tra cảm quan

Kiểm tra bằng mắt thường: vắc xin dạng bánh xốp, dễ tách khỏi thành lọ.

4.2. Kiểm tra độ thuần khiết: Theo TCVN 8684:2011.

4.2.1. Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn

4.2.2. Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc

4.3. Kiểm tra tính an toàn

...

...

...

Vắc xin được coi là đạt nếu tất cả lợn sống khỏe mạnh, không có phản ứng cục bộ, có thể có phản ứng sốt nhẹ (tăng 0,5 °C sau khi tiêm từ 3 đến 5 ngày).

4.4. Kiểm tra hiệu lực

4.4.1. Phương pháp trọng tài

4.4.1.1. Gây miễn dịch

Tiêm cho 5 con lợn, mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. 3 con lợn đối chứng không tiêm vắc xin.

28 ngày sau mũi tiêm cuối cùng, 5 con lợn được tiêm và 3 con lợn đối chứng được tiến hành lấy máu và công cường độc bằng chủng vi rút gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản được phân lập tại Việt Nam.

Theo dõi 21 ngày sau công cường độc.

4.4.1.2. Các chỉ tiêu đánh giá hiệu lực

4.4.1.2.1. Đánh giá kết quả công cường độc

...

...

...

- Lô đối chứng: Lợn chết vì hội chứng PRRS hoặc có triệu chứng, bệnh tích điển hình của hội chứng PRRS.

4.4.1.2.2. Đánh giá hiệu giá kháng thể hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản bằng phản ứng ELISA

Lấy máu, thu huyết thanh tại các thời điểm 0 và 21 ngày sau công cường độc và đánh giá hàm lượng kháng thể bằng phản ứng ELISA.

Kết quả: Đánh giá theo bộ kit được sử dụng.

4.4.1.2.3. Đánh giá hiệu giá kháng thể hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản bằng phản ứng miễn dịch có gắn men trên tế bào 1 lớp (IPMA - Immunoperoxidase monolayer assay)

Lấy máu, thu huyết thanh tại các thời điểm 0 và 21 ngày sau công cường độc và đánh giá hàm lượng kháng thể bằng phản ứng IPMA

Kết quả: Hiệu giá kháng thể ³ 1/640 (tại thời điểm 21 ngày sau công cường độc): Đạt bảo hộ.

4.4.1.3. Đánh giá kết quả

Vắc xin được coi là đạt nếu đáp ứng được 3 chỉ tiêu nêu trên.

...

...

...

4.4.2.1. Chuẩn bị tế bào MARC-145 trên đĩa 96 giếng

Tế bào MARC-145 được trypsin hóa thành huyễn dịch có mật độ 5 x 10³ tế bào/ml. Cho 100 μl huyễn dịch tế bào trên vào tất cả các giếng. Đậy nắp, ủ tế bào ở 37 °C trong môi trường 5 % CO₂, theo dõi hàng ngày.

Khi quan sát thấy tế bào bám đáy trên 80 % thì tiến hành chuẩn độ vi rút.

4.4.2.2. Chuẩn độ vi rút

- Pha loãng vắc xin trong ống nghiệm theo cơ số 10 bằng môi trường nuôi cấy tế bào từ 10^-1 đến 10^-6 hoặc thấp hơn tùy theo cách bố trí thí nghiệm (xem Hình 1).

- Láy đĩa tế bào MARC-145 đã nuôi, loại bỏ môi trường cũ.

- Rửa tế bào bằng dung dịch PBS (-), 200 μl/giếng, sau đó loại bỏ dung dịch PBS (-).

1

...

...

...

3

4

5

6

7

8

9

10

11

...

...

...

A

...

...

...

B

10^-1

10^-1

10^-1

10^-1

10^-1

...

...

...

C

10^-2

10^-2

...

...

...

10^-2

10^-2

ĐCTB

...

...

...

10^-3

10^-3

10^-3

10^-3

10^-3

ĐCTB

...

...

...

E

10^-4

10^-4

10^-4

10^-4

10^-4

ĐCTB

...

...

...

F

10^-5

10^-5

10^-5

...

...

...

10^-5

ĐCTB

G

...

...

...

10^-6

10^-6

10^-6

10^-6

ĐCTB

...

...

...

H

...

...

...

Hình A.1 - Sơ đồ bố trí phản ứng chuẩn độ vi rút trên tế bào

- Hút 100 μl huyễn dịch vắc xin đã pha loãng lần lượt vào các giếng tương ứng trên đĩa tế bào (từ B1 đến G5), dãy đối chứng tế bào (từ B6 đến G6), cho 100 μl môi trường duy trì vào mỗi giếng.

- Ủ tế bào ở 37 °C trong môi trường có 5 % CO₂ trong 30 min.

- Rửa tế bào bằng dung dịch PBS (-), 200 μl/giếng, loại bỏ dung dịch PBS (-).

- Cho 200 μl môi trường duy trì vào mỗi giếng.

...

...

...

- Đọc kết quả: giếng có bệnh tích tế bào là dương tính.

4.4.2.3. Tính kết quả

Theo công thức Spearman-Karber:

λ.TCID₅₀ (0,1 ml) = X + 1/2 - (N_x/n)

Trong đó:

X là logarit cơ số 10 của độ pha loãng vi rút có 100 % giếng xuất hiện bệnh tích tế bào;

N_x là tổng số giếng có bệnh tích tế bào trong thí nghiệm;

n là số giếng của mỗi độ pha loãng;

λ là độ pha loãng vi rút.

...

...

...

Vắc xin được coi là đạt nếu mỗi liều vắc xin có ít nhất 10⁵TCID₅₀.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Chapter 2.8.7: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, OIE Terrestrial Manual 2010

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-12:2014 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 12: Vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS)