4  Nguyên tắc

Lấy giống vi rút Gumbro nhược độc được giữ ở dạng đông khô để kiểm tra đặc tính sinh học của giống bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm. Giống được bồi dưỡng bằng cách cấy truyền trên tế bào xơ phôi gà 1 lớp, sau 48 h đến 72 h, giống được thu hoạch, giám định vi rút bằng phương pháp RT-PCR, nếu giống vi rút Gumbro nhược độc đạt yêu cầu được đông khô và bảo quản quản ở nhiệt độ âm 80 °C.

5  Vật liệu và thuốc thử

5.1  Vật liệu

5.1.1  Giống vi rút Gumbro nhược độc chủng 2512 thuộc serotype 1, họ Birnaviridae, được đông khô với lượng giống 0,1 ml/lọ với hiệu giá vi rút là 10³ TCID₅₀/0,1 ml, được kiểm tra vô trùng, thuần khiết, tính an toàn, tính miễn dịch, tính nhân lên của vi rút

5.1.2  Gà 14 ngày tuổi (gà khỏe mạnh, không có kháng thể kháng vi rút Gumboro, có nguồn gốc từ đàn gà bố mẹ khỏe mạnh)

5.1.3  Tế bào xơ phôi gà một lớp trên đĩa nhựa đáy phẳng 96 giếng hoặc chai Flash T25 hoặc T75

5.1.4  Trứng gà SPF có phôi từ 9 ngày tuổi đến 11 ngày tuổi

5.1.5  Giống vi rút Gumboro cường độc

...

...

...

5.2.1  Dung dịch PBS pH 7,2 (xem phụ lục A)

5.2.2  Môi trường nuôi cấy tế bào

5.2.3  Thạch Agar

5.2.4  Huyết thanh dương tính chuẩn (với Gumboro)

5.2.5  Kháng nguyên chuẩn (với Gumboro)

5.2.6  Huyết thanh âm tính chuẩn (với Gumboro)

5.2.7  Bộ kit dùng cho phản ứng RT-PCR

5.2.8  Các loại kháng sinh Penicillin (200 Ul/ml), Streptomycin (200 μg/ml)

5.2.9  Sữa bò tách bơ 10% (xem phụ lục A)

...

...

...

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1  Tủ lạnh (có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C), tủ lạnh sâu (có thể duy trì nhiệt độ âm 80 °C)

6.2  Tủ ấm CO₂ có thể duy trì nhiệt độ 37 °C

6.3  Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2400 rpm

6.4  Máy khuấy từ có tốc độ khuấy tới 2400 vòng/phút

6.5  Nồi cách thủy có thể duy trì ở các nhiệt độ 100 °C, 110 °C, 121 °C trong thời gian 10 min, 15 min, 20 min

6.6  BSC II màng lọc ULPA với hiệu suất lọc 99,99% đối với các hạt có kích thước 0,1 - 0,3 mm

6.7  Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc tới 12 000 g

...

...

...

6.9  Máy RT-PCR

6.10  Máy điện di kiểm tra sản phẩm PCR/RT-PCR của hãng Fermentas và Bio-Rad

6.11  Máy soi gel Dolphin-Doc (Wealtech, Mỹ)

6.12  Máy tính và các phần mềm sinh - tin học

6.13  Micropipet, dung tích từ 0,5 μl đến 10 μl, từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000 μl

6.14  Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl

6.15  Chai nuôi cấy tế bào T25, T75

6.16  Đầu tip phù hợp với micropipet

6.17  Đèn soi trứng

...

...

...

6.19  Cốc có mỏ, dung tích 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml

6.20  Bộ cối chày sứ vô trùng

6.21  Lọ đông khô giống vô trùng

6.22  Đĩa Petri vô trùng

6.23  Dao, kéo, panh kẹp vô trùng

6.24  Chai Schott vô trùng 100 ml, 200 ml, 500ml

7  Yêu cầu của giống vi rút Gumboro nhược độc

7.1  Yêu cầu kỹ thuật đối với ống giống

- Lọ kín, không rạn nứt, đảm bảo chân không.

...

...

...

7.2  Yêu cầu sinh học của giống

- Giống vi rút đảm bảo vô trùng (không bị tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc), đảm bảo thuần khiết (không bị tạp nhiễm Mycoplasma, Salmonella và vi rút ngoại lai)

- Giống vi rút được nhận dạng bằng phương pháp RT-PCR (xuất hiện vạch giống như mẫu đối chứng dương) hoặc phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (vi rút kết tủa với kháng huyết thanh đặc hiệu tạo thành đường kết tủa màu trắng)

- Hiệu giá vi rút của giống phải đạt ít nhất 10³ TCID₅₀/0,1 ml

- Giống vi rút được kiểm tra tính an toàn trên gà (khi nhỏ giống vi rút cho gà thì gà sống khỏe, không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Gumboro)

- Giống vi rút được kiểm tra khả năng nhân lên của vi rút trên môi trường tế bào xơ phôi gà 1 lớp (sau 48 h đến 72 h gây nhiễm, vi rút nhân lên và phá hủy ≥ 80% diện tích tế bào)

- Giống vi rút được kiểm tra tính gây miễn dịch bằng phương pháp công cường độc hoặc phương pháp trung hòa.

8  Cách tiến hành

8.1  Nhận dạng giống

...

...

...

8.1.1  Nhận dạng vi rút bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch AGID

Giống vi rút (5.1.1) được nhận dạng bằng phương pháp kết tủa khuếch tán miễn dịch trên thạch (AGID). Vi rút (5.1.1) kết tủa với kháng huyết thanh đặc hiệu tạo thành đường kết tủa màu trắng khi thực hiện phản ứng kết tủa khuếch tán miễn dịch trên thạch (xem phụ lục C).

8.1.2  Nhận dạng vi rút bằng phương pháp RT- PCR

Giống vi rút (5.1.1) được nhận dạng bằng phương pháp RT - PCR (tham khảo phụ lục F).

8.2  Kiểm tra vô trùng

8.2.1  Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn. Theo TCVN 8684:2011

8.2.2  Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc. Theo TCVN 8684:2011

8.3  Kiểm tra thuần khiết

8.3.1  Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma. Theo TCVN 8684:2011

...

...

...

8.3.3  Kiểm tra vi rút ngoại lai

Kiểm tra tạp nhiễm vi rút Cúm gia cầm được tiến hành bằng phản ứng RT-PCR (tham khảo phụ lục B).

8.4  Chuẩn độ vi rút

Chuẩn độ giống vi rút (5.1.1) trên môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 1 lớp (5.1.3) được thực hiện ở tấm nhựa 96 giếng đáy bằng (xem phụ lục D). Giống đạt yêu cầu khi hiệu giá vi rút của giống phải đạt 10³ TCID₅₀/0,1 ml.

8.5  Kiểm tra tính an toàn

8.5.1  Chuẩn bị

- 10 gà (5.1.2).

- Giống vi rút (5.1.1) được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha loãng với PBS (5.2.1) thành nồng độ 10^-3.

8.5.2  Cách tiến hành

...

...

...

8.5.3  Đánh giá kết quả

Giống vi rút (5.1.1) được coi là an toàn khi: Sau 21 ngày nhỏ giống vi rút (5.1.1) 10/10 gà (5.1.2) sống khỏe, không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Gumboro. Toàn bộ gà thí nghiệm bị giết và kiểm tra bệnh tích, không có gà thí nghiệm nào có bệnh tích của bệnh Gumboro.

Ghi chú: - Triệu chứng điển hình của bệnh Gumboro: Gà quay đầu tự mổ vào hậu môn, gà có dấu hiệu hoảng loạn và có tiếng kêu khác thường. Sau 2 ngày đến 3 ngày gà bị ỉa chảy, phân loãng, nhiều nước, trắng, nhớt

- Bệnh tích của bệnh Gumboro: Xuất huyết cơ đùi, cơ ngực; thận và lách sưng; túi Fabricius sưng, xuất huyết có dịch nhày xung quanh.

8.6  Kiểm tra khả năng nhân lên của vi rút

Kiểm tra khả năng nhân lên của giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 trên môi trường tế bào xơ phôi gà 1 lớp (5.1.3).

8.6.1  Chuẩn bị

- Tế bào xơ phôi gà 1 lớp (5.1.3) (xem phụ lục A.6).

- Giống vi rút (5.1.1) được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha loãng với môi trường nuôi cấy tế bào (5.2.2) thành nồng độ 103 TCID₅₀/0,1 ml.

...

...

...

- Dùng pipette hút bỏ môi trường nuôi cấy (5.2.2) trong chai T25 (6.15) đã có tế bào phát triển.

- Chia huyễn dịch giống vi rút đã pha ở trên vào các chai nuôi cấy.

- Bổ sung môi trường nuôi cấy (5.2.2) sao cho lượng môi trường cho vào bằng lượng môi trường hút ra.

- Tiếp tục nuôi cấy chai tế bào trong tủ ấm CO₂ ở nhiệt độ 37 °C từ 48 h đến 72 h.

- Hàng ngày kiểm tra sự phát triển của vi rút và bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi ngược.

8.6.3  Đánh giá kết quả

Giống vi rút (5.1.1) đạt yêu cầu khi: Sau 48 h đến 72 h gây nhiễm (8.6.2), vi rút nhân lên và phá hủy ≥ 80% diện tích tế bào.

- Bệnh tích tế bào: Các tế bào vỡ ra, co cụm thành từng khối, bong ra khỏi thành giếng.

8.7  Kiểm tra tính gây miễn dịch

...

...

...

8.7.1  Phương pháp công cường độc

8.7.1.1  Chuẩn bị

- 20 gà (5.1.2)

- Giống vi rút (5.1.1) được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha loãng với môi trường nuôi cấy (5.2.2) thành nồng độ 10³ TCID₅₀/0,1 ml.

8.7.1.2  Cách tiến hành

- 20 gà (5.1.2) được chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm miễn dịch: 10 gà (5.1.2) được nhỏ mắt, mũi hoặc cho uống mỗi con 0,1 ml giống vi rút (5.1.1) đã pha loãng ở trên.

+ Nhóm đối chứng: 10 gà (5.1.2) được nhỏ mắt, mũi hoặc cho uống mỗi con 0,1 ml PBS (5.2.1).

- Sau 14 ngày cả hai nhóm gà được công cường độc bằng giống vi rút Gumboro cường độc (5.1.5) liều 10² CID₅₀/0,1 ml.

...

...

...

8.7.1.3  Đánh giá kết quả

- Giống vi rút Gumboro (5.1.1) đạt tiêu chuẩn về tính gây miễn dịch khi:

+ Nhóm miễn dịch ít nhất 80% gà không có bệnh tích của bệnh Gumboro.

+ Nhóm đối chứng ít nhất 80% gà có bệnh tích của bệnh Gumboro như xuất huyết cơ đùi, sưng, xuất huyết và có dịch ở túi Fabricius.

8.7.2  Phương pháp trung hòa (SN)

8.7.2.1  Chuẩn bị

- 20 gà (5.1.2).

- Giống vi rút (5.1.1) được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha loãng với môi trường nuôi cấy (5.2.2) thành nồng độ 10³ TCID₅₀/0,1 ml.

8.7.2.2  Cách tiến hành

...

...

...

+ Nhóm miễn dịch: 10 gà (5.1.2) được nhỏ mắt, mũi hoặc cho uống mỗi con 0,1 ml giống vi rút (5.1.1) đã pha loãng ở trên.

+ Nhóm đối chứng: 10 gà (5.1.2) được nhỏ mắt, mũi hoặc cho uống mỗi con 0,1 ml PBS (5.2.1).

- Sau 21 ngày cả hai nhóm gà được lấy máu, chắt huyết thanh kiểm tra hiệu giá kháng thể Gumboro bằng phản ứng trung hòa (SN) (xem phụ lục E).

8.7.2.3  Đánh giá kết quả

- Giống vi rút Gumboro (5.1.1) đạt tiêu chuẩn về tính gây miễn dịch khi:

+ Nhóm miễn dịch ít nhất 80% mẫu huyết thanh kiểm tra đạt hiệu giá kháng thể trung hòa ≥ 1:256.

+ Nhóm đối chứng các mẫu huyết thanh kiểm tra âm tính.

8.8  Bồi dưỡng giống vi rút

8.8.1  Tiêm truyền giống

...

...

...

- Tế bào xơ phôi gà 1 lớp (5.1.3) (xem phụ lục A.6).

- Dùng pipette hút bỏ môi trường nuôi cấy (5.2.2) trong chai T75 (6.15) đã có tế bào phát triển. Lưu ý, trong quá trình hút tránh làm bong tế bào.

- Chia huyễn dịch giống vi rút đã pha ở trên vào các chai nuôi cấy.

- Bổ sung môi trường nuôi cấy (5.2.2) sao cho lượng môi trường cho vào bằng lượng môi trường hút ra.

- Tiếp tục nuôi cấy chai tế bào trong tủ ấm CO₂ ở nhiệt độ 37 °C từ 48 h đến 72 h.

- Hàng ngày kiểm tra sự phát triển của vi rút và bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi ngược.

8.8.2  Thu hoạch giống

- Sau gây nhiễm (8.8.1) 48 h đến 72 h, vi rút nhân lên và phá hủy ≥ 80% diện tích tế bào thì tiến hành thu hoạch huyễn dịch vi rút vào các chai vô trùng (6.24).

- Chọn những chai tế bào có cấy vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 đạt chỉ tiêu vô trùng và có hiệu giá vi rút ≥ 10⁶ TCID₅₀.

...

...

...

- Sau khi kiểm tra sự hiện diện của vi rút, huyễn dịch vi rút được bảo quản ở nhiệt độ âm 70 °C chờ đông khô.

8.9  Đông khô giống vi rút

- Pha huyễn dịch vi rút (8.8.2) với sữa bò tách bơ (5.2.9) và chia vào lọ đông khô (6.21). Giữ ở nhiệt độ âm 80 °C từ 8 h đến 12 h rồi chuyển vào máy đông khô (6.8).

- Chạy đông khô theo quy trình của máy đông khô.

9  Kiểm tra ống giống vi rút sau đông khô

9.1  Kiểm tra đặc tính kỹ thuật của ống giống

- Cảm quan: Quan sát bằng mắt thường, ống giống vi rút được coi là đạt yêu cầu khi lọ kín, không rạn nứt, chế phẩm xốp, màu đồng nhất.

- Chân không: Sử dụng máy đo chân không, ống giống vi rút được coi là đạt yêu cầu khi phát huỳnh quang màu ánh tím.

- Độ ẩm: Sử dụng máy đo độ ẩm, ống giống vi rút được coi là đạt yêu cầu khi độ ẩm dưới 4%.

...

...

...

9.2  Kiểm tra đặc tính sinh học của giống vi rút

Đạt các chỉ tiêu ở mục 7

10  Bao gói, bảo quản ống giống vi rút sau đông khô

Chọn những ống giống đạt chỉ tiêu ở mục 9 để dán nhãn, bao gói và bảo quản:

10.1  Dán nhãn

- Các ống giống vi rút phải được dán nhãn

- Nhãn phải có các thông tin sau:

+ Nơi sản xuất

+ Tên giống

...

...

...

+ Người thực hiện

+ Điều kiện bảo quản

10.2  Bao gói và bảo quản

Ống giống được bao gói bằng giấy, để trong túi Polyeste và được giữ ở nhiệt độ âm 80 °C trong 2 năm.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1  Dung dịch PBS pH 7,2

...

...

...

Kali clorua (KCI)

Natri hiđrophotphat (Na₂HPO₄)

Mono kaliphotphat (KH₂PO₄)

Nước

8 g

2 g

1,15 g

0,2 g

1000 ml

...

...

...

A.2  Dung dịch sữa bò tách bơ 10%

Sữa bò tách bơ PBS

PBS 90 ml

10 g

90 ml

Đun sôi PBS rồi để nguội đến nhiệt độ 50 °C đến 70 °C rồi cho sữa bò tách bơ vào, lắc đều cho sữa tan hết.

A.3  Kháng nguyên chuẩn

- Gây nhiễm giống cường độc Gumboro cho gà mẫn cảm (3 tuần tuổi đến 5 tuần tuổi) nhỏ vào mắt và mũi gà mỗi con 200 μl (10²CID₅₀).

- Sau 03 ngày gây nhiễm thu hoạch túi Fabricius, nghiền túi Fabricius có bệnh tích điển hình trong nước sinh lý với tỷ lệ 1:10 (1g túi Fabricius : 9 ml PBS pH 7,2).

...

...

...

- Giải đông tan 3 lần đến 5 lần.

- Ly tâm 3000 r/min trong 15 min thu lấy nước trong ở trên, bỏ cặn. Chia ống nhỏ, bảo quản âm 70 °C.

- Cũng có thể dùng giống Gumboro cường độc tiêm vào màng niệu nang phôi gà 9 ngày đến 10 ngày thu hoạch phôi và nước niệu nang của các phôi chết trong vòng 48 h đến 96 h sau khi tiêm, trộn và xử lý như trên.

A.4  Chế tạo huyết thanh dương tính chuẩn

- Dùng gà trống choai khỏe mạnh (4 tuần tuổi đến 5 tuần tuổi, không có kháng thể kháng vi rút Gumboro).

- Nhỏ mắt mũi cho mỗi gà 200 μl giống Gumboro cường độc (nồng độ 10^-1).

- Sau 7 ngày nhỏ tiếp 200 μl giống Gumboro cường độc (nồng độ 10^-1) lần 2.

- Nhỏ tiếp lần 3 và lần 4 cách 7 ngày.

- Sau lần nhỏ lần 4, 28 ngày lấy máu gà để lấy huyết thanh, chia ống bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C dùng dần (thời gian bảo quản 1 năm).

...

...

...

- Lấy huyết thanh của gà khỏe mạnh chưa tiêm phòng vắc xin Gumboro.

- Dùng kháng nguyên Gumboro chuẩn: Để xác định kháng thể trong huyết thanh của đàn gà cần kiểm tra (xác định mức độ kháng thể trong đàn gà miễn dịch).

- Chuẩn bị đĩa thạch: Dùng dung dịch PBS 0.01 M (pH7.2) cho thêm 8% muối NaCI, 1% thạch Agar, 0.5 ml phenol đun cho tan thạch, đổ ra đĩa lồng mỗi đĩa 10 ml (thực hiện vô trùng), để nguội cho đông lại, đục lỗ tròn trên đĩa thạch, 1 lỗ giữa đĩa và 6 lỗ xung quanh, đường kính lỗ là 3 mm, các lỗ cách nhau 3 mm.

- Cho thành phần phản ứng vào các lỗ: Lỗ chính giữa cho Kháng nguyên chuẩn, các lỗ xung quanh lỗ 1-4 cho huyết thanh cần kiểm tra và lỗ 5 cho huyết thanh đối chứng dương và lỗ 6 cho huyết thanh đối chứng âm. Cho đĩa vào hộp để ở nhiệt độ 37 °C, quan sát trong 3 ngày.

- Kết quả: Sau khi quan sát đối chứng dương và đối chứng âm rõ ràng, quan sát các lỗ thí nghiệm nếu thấy giữa lỗ thí nghiệm và lỗ kháng nguyên dương tính có vạch ngưng kết thì kết luận phản ứng dương tính, không có vạch ngưng kết giống đối chứng âm thì phản ứng âm tính.

A.6  Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp

Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 1 lớp được tiến hành theo các bước sau:

-Trứng gà SPF có phôi đã ấp được 9 ngày.

- Soi để chọn những quả có phôi sống, khỏe.

...

...

...

- Gắp phôi ra đĩa Petri có chứa PBS không bổ sung calcium, magnesium và được làm ấm ở nhiệt độ 37 °C.

- Rửa phôi 3 lần bằng PBS, cắt đầu, chân, và loại bỏ nội tạng.

- Sau đó cắt nhỏ phôi và rửa trên máy khuấy từ 2 lần.

- Rửa tiếp bằng dung dịch Trypsin 0,125%.

- Hút bỏ phần nước trong ở trên.

- Tiêu hóa tế bào bằng dung dịch Trypsin 0,25% trên máy khuấy từ trong phòng ấm 37 °C từ 30 - 60 min.

- Lọc tế bào qua lưới lọc và ly tâm lạnh với tốc độ 2000 r/min.

- Chắt bỏ nước trong, dùng môi trường phát triển để pha loãng tế bào.

- Đếm tế bào trên buồng đếm hồng cầu, định lượng tế bào.

...

...

...

Kích cỡ chai

Lượng tế bào nuôi cấy (tế bào)

Tổng lượng môi trường nuôi cấy (ml)

T25

2.0 - 6,0 x 10⁵

5 - 8 ml

T75

9.0 - 15.0 x 10⁵

15 - 30 ml

...

...

...

- Hàng ngày quan sát sự phát triển của tế bào xơ phôi gà trong các chai tế bào bằng kính hiển vi soi ngược.

Phụ lục B

(Tham khâo)

Phản ứng RT-PCR kiểm tra tạp nhiễm với vi rút cúm gia cầm

B.1  Chiết tách ARN

Chiết tách ARN bằng bộ kít, khi sử dụng theo hướng dẫn của nhả sản xuất.

B.2  Tiến hành phản ứng RT-PCR

Áp dụng cho bộ Maxime RT-PCR PreMix kit (iNtRON Biotechnology)

...

...

...

Thể tích (μl)

H₂O

9

Dung dịch đệm RT- PCR (Tris/HCl và KCl)

1

OptiScript reverse transcriptase

2

dNTP

1

...

...

...

1

Mồi xuôi (10pmole/ μl)

1

Mồi ngược (10pmole/ μl)

1

Mẫu ARN

4

Tổng cộng

20

...

...

...

Mồi

Trình tự chuỗi mối (5’ → 3’)

Kích thước sản phẩm

H5-155F

5'-ACACATGCYCARGACATACT-3'

545bp

H5-699R

5'-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3'

N1-F

...

...

...

126bp

N1-R

5'-ACCGTCTGGCCAAGACCA-3'

B.3  Chu trình nhân gen

Bước

Chu kỳ

Thời gian

Nhiệt độ (°C)

Bước 1

...

...

...

30 min

45

Bước 2

1 chu kỳ

5 min

94

Bước 3

40 chu kỳ

30 s

...

...

...

30 s

72

20 s

94

Bước 4

1 chu kỳ

5 min

72

Bước 5

...

...

...

∞

4

B.4  Chạy điện di

Chuẩn bị thạch agaroze 2% pha trong dung dịch TAE 1X hoặc TBE 1X có ethidi bromua (10 μg/μl).

Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).

Thạch khô, rút lược ra và cho mẫu vào các giếng (8 μl sản phẩm PCR + 2 μl dung dịch tải).

Sử dụng thang chuẩn (Marker), trọng lượng phân tử thang 100 bp trở lên.

Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm đi kèm (mẫu đối chứng âm có thể là nước cất sạch).

B.5  Đọc kết quả

...

...

...

Mẫu âm tính: Không có vạch.

B.6  Đánh giá kết quả

Có vi rút Cúm gia cầm trong mẫu chạy nếu kết quả RT-PCR dương tính.

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp kết tủa khuếch tán miễn dịch trên thạch AGID

(Agar gel immunoffusion)

C.1  Mục đích

...

...

...

C.2  Nguyên tắc của phản ứng AGID

Phản ứng dương tính khi một kháng nguyên và một kháng thể tương ứng, nằm cách nhau một khoảng trong thạch, chúng sẽ khuếch tán và tại chỗ gặp nhau sẽ hình thành đường kết tủa màu trắng. Sự kết tủa này xảy ra ở vùng mà tỷ lệ kháng nguyên và kháng thể tương ứng đồng đều.

C.3  Chuẩn bị kháng nguyên

Giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 70 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha loãng với PBS thành các nồng độ từ 10^-2 đến 10^-4.

C.4  Chuẩn bị thạch làm phản ứng

+ Hòa tan NaCl (8,0 g) và Phenol (0,5 ml) vào nước cất. Chú ý cho NaCl vào trước, sau đó cho Phenol.

+ Chỉnh pH: 7,2 - 7,4 (dùng NaOH N/1).

+ Cho thạch Agar vào hấp.

+ Lọc qua 8 lần vải gạc.

...

...

...

+ Sau khi đổ ra đĩa để tủ lạnh 4 h rồi mới tiến hành đục lỗ thạch.

C.5  Cách tiến hành phản ứng phát hiện kháng nguyên

+ Lỗ giữa nhỏ kháng huyết thanh dương tính chuẩn 0,025 ml.

+ Các lỗ xung quanh lần lượt nhỏ huyễn dịch giống đã pha ở các nồng độ (C.3), trong đó có một lỗ cho kháng nguyên dương tính chuẩn và một lỗ cho PBS, mỗi lỗ nhỏ 0,025 ml.

+ Để đĩa thạch làm phản ứng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và trong hộp giữ ẩm.

+ Đọc kết quả trong vòng từ 24 h đến 48 h (có thể cho phản ứng giả).

C.6  Đọc kết quả

Phản ứng dương tính có một vạch kết tủa màu trắng đục, gọn, sắc nét, không có đường phụ.

...

...

...

(Quy định)

Phương pháp chuẩn độ vi rút

D.1  Chuẩn bị

- Chuẩn bị đĩa nhựa 96 giếng đáy bằng có 1 lớp tế bào xơ phôi gà.

- Môi trường tế bào DMEM.

- Giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512.

D.2  Cách tiến hành

- Giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 70 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi được hoàn nguyên trở lại với môi trường nuôi cấy thành 1ml.

- Pha loãng giống vi rút trong ống nghiệm theo cơ số 10 bằng môi trường nuôi cấy tế bào từ 10^-1 đến 10^-8.

...

...

...

- Rửa tế bào bằng môi trường nuôi cấy, 200 μl/giếng, sau đó loại bỏ môi trường nuôi cấy.

- Hút 100 μl huyễn dịch vi rút đã pha loãng lần lượt vào các giếng tương ứng trên đĩa tế bào (từ A1 đến H5), dãy đối chứng tế bào (từ A6 đến H6),cho 100 μl môi trường duy trì vào mỗi giếng.

Sơ đồ bố trí phản ứng chuẩn độ vi rút trên tế bào

1

2

3

4

5

...

...

...

7

8

9

10

11

12

A

10-1

10-1

...

...

...

10-1

10-1

ĐCTB

...

...

...

10-2

10-2

10-2

10-2

10-2

ĐCTB

...

...

...

C

10-3

10-3

10-3

10-3

10-3

ĐCTB

...

...

...

D

10-4

10-4

10-4

...

...

...

10-4

ĐCTB

E

...

...

...

10-5

10-5

10-5

10-5

ĐCTB

...

...

...

F

10-6

10-6

10-6

10-6

10-6

ĐCTB

...

...

...

G

10-7

10-7

10-7

10-7

...

...

...

ĐCTB

H

10-8

...

...

...

10-8

10-8

10-8

ĐCTB

...

...

...

- Ủ tế bào ở nhiệt độ 37 °C có 5% CO₂ trong 30 min.

- Loại bỏ huyễn dịch trong các giếng.

- Rửa tế bào bằng môi trường nuôi cấy, 200 μl/giếng, loại bỏ môi trường nuôi cấy.

- Cho 200 μl môi trường duy trì vào mỗi giếng.

- Nuôi tế bào ở nhiệt độ 37 °C có 5% CO₂, theo dõi hàng ngày, trong 5 ngày.

D.3  Đánh giá kết quả

Giếng có bệnh tích tế bào là dương tính.

- Bệnh tích tế bào: Các tế bào vỡ ra, co cụm thành từng khối, bong ra khỏi thành giếng (hoặc chai nuôi cấy).

- Tính toán liều gây nhiễm 50% (TCID₅₀) theo phương pháp của Reed Muench, 1938:

...

...

...

Trong đó:

X là logarit cơ số 10 của độ pha loãng vi rút có 100% giếng xuất hiện bệnh tích tế bào.

N_x là tổng số giếng có bệnh tích tế bào trong thí nghiệm.

n là số giếng của mỗi độ pha loãng.

λ là độ pha loãng vi rút.

- Kết quả: Giống vi rút được coi là đạt nếu mỗi liều vắc xin có ít nhất 10³TCID₅₀.

Phụ lục E

(Quy định)

...

...

...

E.1  Chuẩn bị tế bào xơ phôi gà trên đĩa 96 giếng đáy bằng

Xem phụ lục A.6.

E.2  Chuẩn bị vi rút

Giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 70 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha loãng với môi trường nuôi cấy thành nồng độ 10³TCID₅₀/0,1 ml.

E.3  Chuẩn bị huyết thanh

Toàn bộ gà thí nghiệm được lấy máu để chắt huyết thanh, huyết thanh chắt xong được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C.

E.4  Cách tiến hành

- Pha loãng các mẫu huyết thanh miễn dịch theo cơ số 2, từ 1/2 đến 1/1028 trong môi trường nuôi cấy tế bào.

- Trung hòa: Lấy 100 μl huyết thanh đã được pha loãng ở các nồng độ bổ sung 100 μl huyễn dịch vi rút có chứa 10³ TCID₅₀, ủ 30 min ở nhiệt độ phòng.

...

...

...

Sơ đồ bố trí phản ứng trung hòa

1

2

3

4

5

6

7

...

...

...

9

10

11

12

Huyết thanh pha loãng

A

ĐCTB

Mẫu 1

Mẫu 2

...

...

...

Mẫu 4

Mẫu 5

Mẫu 6

Mẫu 7

Mẫu 8

Mẫu 9

Mẫu 10

ĐCVR

1/8

...

...

...

ĐCTB

...

...

...

ĐCVR

1/16

C

ĐCTB

...

...

...

ĐCVR

1/32

D

ĐCTB

...

...

...

...

...

...

1/64

E

ĐCTB

...

...

...

ĐCVR

1/128

F

ĐCTB

...

...

...

ĐCVR

1/256

...

...

...

ĐCTB

...

...

...

ĐCVR

1/512

H

ĐCTB

...

...

...

ĐCVR

1/1028

ĐCTB: Đối chứng tế bào

ĐCVR: Đối chứng vi rút

...

...

...

- Loại bỏ huyễn dịch trong các giếng.

- Rửa tế bào bằng môi trường nuôi cấy, 200 μl/giếng, loại bỏ môi trường nuôi cấy.

- Cho 200 μl môi trường duy trì vào mỗi giếng.

- Nuôi tế bào trong tủ ấm CO₂ ở nhiệt độ 37 °C, theo dõi trong 5 ngày.

E.5  Đọc kết quả

Giếng có bệnh tích tế bào là dương tính (không có kháng thể kháng Gumboro).

Giếng không có bệnh tích tế bào là âm tính (có kháng thể kháng Gumboro).

- Bệnh tích tế bào: Các tế bào vỡ ra, co cụm thành từng khối, bong ra khỏi thành giếng (hoặc chai nuôi cấy).

- Kết quả: Huyết thanh đạt hiệu giá ít nhất 1/256.

...

...

...

Phụ lục F

(Tham khảo)

Phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512

F.1  Chiết tách ARN

Chiết tách ARN bằng bộ kít, khi sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

F.2  Tiến hành phản ứng RT-PCR

Áp dụng cho bộ Maxime RT-PCR PreMix kit (iNtRON Biotechnology)

Nguyên liệu

Thể tích (μl)

...

...

...

9

Dung dịch đệm RT- PCR (Tris/HCI và KCI)

1

OptiScript reverse transcriptase

2

dNTP

1

i-StarTaq DN A polymerase

1

...

...

...

1

Mồi ngược (10pmole/ μl)

1

Mẫu ARN

4

Tổng cộng

20

Danh sách các cặp mồi dùng cho phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512

Tên mồi

...

...

...

Nồng độ sử dụng

GVF(Kz2)

CCGGAATTCGCCGCCGCCATGACAAACCTGCAAGA

10pM

GKZF

CCGGAATTCGCCGCCGCCATGACAAACCTGCAAGAT

10pM

GSALR

GAATCCCGTCGACTACAGGATTCTG

...

...

...

GSALF

CAGAATCCYGTAGTCGACGGGATTC

10pM

GNOR

ATAAGAATGCGGCCGCTTATCACTCAAGGTCCTCA

10pM

G908F

GCCAATCACATCCATCAAACTG

10pM

...

...

...

ATAAGAATGCGGCCGCTCATTACCTCCTTATGGCCCGGATTATGTC

10pM

F.3  Chu trình nhân gen

Bước

Chu kỳ

Thời gian

Nhiệt độ (°C)

Bước 1

1 chu kỳ

...

...

...

45

Bước 2

1 chu kỳ

5 min

94

Bước 3

40 chu kỳ

30 s

52

...

...

...

72

20 s

94

Bước 4

1 chu kỳ

5 min

72

Bước 5

1 chu kỳ

...

...

...

4

F.4  Chạy điện di

Chuẩn bị thạch agaroze 2% pha trong dung dịch TAE 1X hoặc TBE 1X có ethidi bromua (10 μg/μl).

Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).

Thạch khô, rút lược ra và cho mẫu vào các giếng (8 μl sản phẩm PCR + 2 μl dung dịch tải).

Sử dụng thang chuẩn (Marker), trọng lượng phân tử thang 100 bp trở lên.

Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm đi kèm (mẫu đối chứng âm có thể là nước cất sạch).

F.5  Đọc kết quả

Mẫu dương tính: Xuất hiện vạch giống với mẫu đối chứng dương tính.

...

...

...

F.6  Đánh giá kết quả

Có vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 trong mẫu chạy nếu kết quả RT-PCR dương tính.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE 2015: Chapter 2.3.12: Infectious Bursal Disease (Gumboro disease)

[2] Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xây dựng danh mục giống vi rút gia cầm Quốc gia - Mục 3.3 - Phương pháp nghiên cứu - Mục 3.1.3 - Nguyên liệu và hóa chất - Mục 3.3.4 - Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp, Mục 3.3.5 Phương pháp gây nhiễm vi rút, Mục 3.3.6 - Phương pháp chuẩn độ vi rút, Mục 3.3.18 Phương pháp giải trình tự gen của vi rút

[3] Bệnh truyền nhiễm của động vật nuôi và biện pháp khống chế - Nhà xuất bản nông nghiệp - Bệnh Gumboro (Gumboro disease, Infectious Bursal Disease) - Trang 387-395

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8683-16:2017 về Giống vi sinh vật thú y - Phần 16: Quy trình giữ giống vi rút gumboro nhược độc chủng 2512