4  Thuốc thử, vật liệu thử và môi trường nuôi cấy

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích; sử dụng nước cất hoặc nước khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ khi có quy định khác.

4.1  Bộ thuốc nhuộm Gram (Xem Phụ lục A.1)

4.2  Bộ thuốc nhuộm Giemsa (Xem Phụ lục A.2)

4.3  Môi trường BHI (Xem Phụ lục B.1)

4.4  Môi trường thạch máu (Xem Phụ lục B.2)

4.5  Máu, là máu cừu hoặc máu bê hoặc máu thỏ, vô trùng.

4.6  Môi trường thạch MacConkey (Xem Phụ lục B.3)

4.7  Các môi trường xác định các đặc tính sinh hóa (Xem Phụ lục C)

...

...

...

4.9  Nguyên liệu cho Realtime PCR (Xem Phụ lục E)

4.10  Nguyên liệu cho LAMP (Xem Phụ lục F)

4.11  Nước muối sinh lý, là dung dịch NaCl 0,9 %, vô trùng.

4.12  Chất chống đông, là EDTA hoặc heparin hoặc citrat natri 3,8 %.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Tủ ấm, duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0,5 °C

5.2  Kính hiển vi, có vật kính với độ phóng đại 10 X, 40 X, 100 X

5.3  Nồi hấp, duy trì ở nhiệt độ 121 °C.

...

...

...

5.5  Máy Realtime PCR

5.6  Máy PCR

5.7  Bộ điện di, gồm bộ nguồn điện di, bể điện di, khay điện di.

5.8  Máy đọc gel

5.9  Pank, kéo, vô trùng.

5.10  Bể điều nhiệt, duy trì nhiệt độ từ 56 °C ± 0,5 °C.

5.11  Bơm tiêm, có dung tích 5 ml, 10 ml, vô trùng.

5.12  Kim tiêm, loại 18 G hoặc 20 G hoặc 23 G, vô trùng.

5.13  Ống nghiệm, có thể tích từ 10 ml đến 15 ml, sạch và vô trùng.

...

...

...

5.15  Que cấy, vô trùng.

5.16  Bông cồn, bông cot-ton đã được tẩm cồn 70 %

5.17  Tăm bông, vô trùng.

5.18  Phiến kính, sạch.

5.19  Cưa, kìm, vô trùng.

5.20  Cối chày sứ nghiền mẫu, vô trùng.

5.21  Ống ly tâm (hay ống eppendorf), vô trùng, có thể tích 0,2 ml, 1,5 ml.

5.22  Tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C

5.23  Máy lắc (Máy vortex), có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2 400 rpm

...

...

...

6  Chẩn đoán lâm sàng

6.1  Đặc điểm dịch tễ

- Bệnh tụ huyết trùng là bệnh truyền nhiễm ở nhiều loài động vật, phổ biến ở lợn, trâu, bò, gia cầm. Bệnh xảy ra thường ở thể cấp tính. Ở lợn, trâu, bò mắc bệnh do P. multocida typ A với đặc trưng là sốt và viêm phổi; Lợn, trâu, bò mắc bệnh do P. multocida typ B với đặc trưng là xuất huyết, nhiễm trùng huyết; Gia cầm mắc bệnh do P. multocida typ A với đặc trưng là tiêu chảy, phân lỏng;

- Động vật mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh tụ huyết trùng. Trâu, bò thường mắc lúc 2 tuổi đến 3 tuổi; Lợn thường mắc lúc 16 tuần tuổi đến 18 tuần tuổi; Gia cầm thường mắc lúc 3 tuần tuổi đến 4 tuần tuổi;

- Bệnh tụ huyết trùng xảy ra quanh năm, nhưng hay gặp nhất là lúc thời tiết giao mùa, ở miền Bắc là lúc thời tiết chuyển từ mùa xuân sang mùa hè và mùa thu sang mùa đông; ở miền Nam là từ mùa mưa sang mùa khô và ngược lại;

- Bệnh lây trực tiếp từ con ốm sang con khỏe qua tiếp xúc, qua đường hô hấp hoặc gián tiếp qua thức ăn nước uống, dụng cụ chăn nuôi, vận chuyển, động vật trung gian như chó, mèo, chuột, côn trùng, ruồi, muỗi, mòng ....

6.2  Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể

6.2.1  Ở lợn

6.2.1.1  Triệu chứng lâm sàng

...

...

...

- Thể cấp tính:

Lợn sốt cao (có thể lên tới 42 °C), khó thở, thở thể bụng.

Da ở vùng bụng, nách, bẹn có màu đỏ tím.

Tỷ lệ chết có thể lên tới 40%.

- Thể bán cấp tính (Thể á cấp tính):

Thể bán cấp tính thường xảy ra ở lợn choai hoặc lợn ở giai đoạn xuất chuồng, từ 16 tuần đến 18 tuần tuổi.

Lợn ho, thở thể bụng.

- Thể mạn tính:

Thường xảy ra ở lợn từ 10 tuần đến 16 tuần tuổi.

...

...

...

6.2.1.2  Bệnh tích đại thể

- Thể cấp tính: Bệnh tích chưa biểu hiện rõ ràng.

- Thể bán cấp tính:

Xoang ngực, xoang bao tim và xoang phúc mạc tích nhiều nước.

Phổi viêm, màu đỏ sẫm do tụ huyết và xuất huyết. Phổi có nhiều điểm bị gan hóa, có nhiều tổ chức xơ hóa, có thể có ổ hoại tử bã đậu. Màng phổi viêm, có thể dính vào lồng ngực.

Hạch ở hầu, họng sưng, xuất huyết.

- Thể mạn tính:

Xác lợn thường gầy.

Phổi có nhiều điểm bị gan hóa, có nhiều tổ chức xơ hóa, có thể có ổ hoại tử bã đậu.

...

...

...

6.2.2  Ở trâu, bò

6.2.2.1  Triệu chứng lâm sàng

Thường gặp ở 3 thể:

- Thể quá cấp tính:

Thể này ít gặp. Trâu, bò phát bệnh nhanh, sốt cao từ 41 °C đến 42 °C, chết nhanh trong vòng 24 h. Trâu, bò có triệu chứng thần kinh như điên cuồng, hung dữ, lồng lên, run rẩy ngã xuống, giãy rụa, ...

- Thể cấp tính:

Thể này xảy ra phổ biến. Thời gian nung bệnh từ 1 ngày đến 3 ngày, trâu, bò sốt cao từ 40 °C đến 42 °C.

Trâu, bò chảy nước mắt, nước mũi liên tục. Các niêm mạc mắt, mũi, miệng đỏ ửng rồi sẫm màu.

Các hạch lympho sưng: đặc biệt là hạch dưới hầu làm cho trâu, bò thè lưỡi ra ngoài, thở khó khăn; hạch trước đùi sưng làm cho trâu, bò đi lại khó khăn.

...

...

...

Tỷ lệ chết có thể lên tới 100 %.

- Thể mạn tính:

Rất ít gặp. Đây là thể tiến triển sau của thể cấp tính nếu trâu, bò không chết. Trâu, bò đi lại khó khăn, viêm khớp mạn tính; viêm phế quản và viêm phổi mạn tính; viêm ruột mạn tính biểu hiện là lúc táo bón, lúc tiêu chảy.

6.2.2.2  Bệnh tích đại thể

- Niêm mạc ở mắt, mũi, mồm và tổ chức liên kết dưới da bị tụ huyết, xuất huyết.

- Các hạch lâm ba, đặc biệt là hạch sau hầu, họng sưng to, xuất huyết.

- Xoang ngực, xoang bụng tích nhiều dịch, có lẫn máu.

- Lòng ống khí quản, phế quản có dịch nhày nhớt, nhiều bọt và xuất huyết.

- Tim sưng to, xoang bao tim tích dịch màu vàng, mỡ vành tim xuất huyết, cơ tim xuất huyết.

...

...

...

6.2.3  Ở gia cầm

6.2.3.1  Triệu chứng lâm sàng

Thường thấy ở 3 thể:

- Thể quá cấp tính:

Gia cầm chết nhanh khi chưa biểu hiện triệu chứng.

- Thể cấp tính:

Gia cầm chết khi mới xuất hiện triệu chứng trong vài giờ đến 2 ngày.

Gia cầm ủ rũ, xù lông, bỏ ăn, thở khó, thở mạnh, có dịch nhớt chảy ra từ miệng và mũi.

Gia cầm tiêu chảy, phân lỏng, nhiều nước, phân lúc đầu trắng sau chuyển thành màu xanh, có thể có dịch nhày, lẫn máu.

...

...

...

- Thể mạn tính:

Đây là thể tiến triển từ thể cấp tính nhưng gia cầm không chết.

Mắt và mũi của gia cầm có chất dịch dính, kết mạc mắt viêm, có dử mắt.

Gia cầm ngoẹo cổ, khó thở, có tiếng khò khè ở khí quản.

Ở vùng đầu, chân, cánh, vùng xương ức của gia cầm có những ổ viêm cục bộ.

6.2.3.2  Bệnh tích đại thể

- Thể quá cấp tính: Chưa biểu hiện bệnh tích.

- Thể cấp tính:

Phổi xuất huyết.

...

...

...

Dạ dày tuyến xuất huyết lấm tấm.

Gan sưng, trên bề mặt có điểm hoại tử lấm tấm.

Buồng trứng xuất huyết.

Ruột xuất huyết từng mảng lớn hay lấm tấm. Chất chứa trong ruột lẫn máu.

- Thể mạn tính:

Phần mặt sưng, kết mạc mắt viêm.

Có các ổ mủ rải rác trong toàn cơ thể.

Phổi sưng, có viêm.

Gan sưng.

...

...

...

6.3  Chẩn đoán phân biệt

6.3.1  Chẩn đoán phân biệt bệnh tụ huyết trùng với một số bệnh khác ở lợn

- Bệnh dịch tả lợn cổ điển: Do vi rút thuộc họ Flaviviridae, giống Pestivirus gây ra. Ban đầu lợn sốt cao (41 °C - 42 °C), phân táo; sau khi giảm sốt lợn tiêu chảy, phân thối khắm đặc trưng. Niêm mạc dạ dày, ruột có nhiều mảng xuất huyết, loét, đặc trưng là nốt loét ở van hồi manh tràng. Hạch lâm ba sưng, xuất huyết (như vân đá hoa, nặng hơn thì thâm tím). Lách không sưng, phần rìa có nhồi huyết răng cưa. Thận xuất huyết điểm lan tràn hoặc thành đám trên bề mặt.

- Bệnh dịch tả lợn Châu Phi: Do vi rút thuộc họ Asfaviridae, giống Asfavirus gây ra. Bệnh tích đặc trưng của bệnh là các hạch lâm ba sưng, xuất huyết; Niêm mạc dạ dày, ruột xuất huyết; Lách sưng, xuất huyết nặng; Thận xuất huyết đinh ghim.

- Bệnh đóng dấu lợn: Do vi khuẩn Erysipelothrix rhusiopathiae gây ra. Trên da có những vết (dấu) đỏ hình vuông, hình tròn,... các vết này lúc đầu đỏ tươi, sau đỏ thẫm, tím bầm, khô lại thành vẩy. Van tim viêm, nhất là van 2 lá viêm ở thể loét, sùi. Khớp gối và khớp bàn chân viêm.

- Bệnh phó thương hàn lợn: Do vi khuẩn Salmonella choleraesuis chủng Kunzendorf và Salmonella typhimurium gây nên. Lợn tiêu chảy. Ở phần tai, mõm, bụng và 4 chân của lợn có xuất huyết, sau dần chuyển sang màu xanh, vàng. Ở gan có hoại tử điểm, ruột già có nhiều vết loét.

- Bệnh viêm teo mũi ở lợn: Do vi khuẩn Bordetella bronchiseptica hoặc vi khuẩn P. multocida typ D hoặc cả hai vi khuẩn này kết hợp gây ra. Biểu hiện đặc trưng của bệnh là viêm mũi, xoang mũi gây teo xương mũi hoặc làm cong bã mía mũi làm cho mặt bị méo mó. Lợn từ 1 tuần đến 3 tuần tuổi là mẫn cảm nhất.

- Bệnh viêm phổi màng phổi: Do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra. Lợn sốt cao (40,5 °C - 41 °C), có ho, phải há mồm ra để thở, có tư thế ngồi để thở. Màng phổi viêm có nhiều sợi tơ huyết (fibrin), có thể viêm dính vào phần sườn. Phổi viêm thành từng mảng, có tính chất đối xứng.

- Bệnh viêm phổi địa phương (bệnh suyễn lợn): Do vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae gây ra. Lợn thường gầy, ho, khó thở, không sốt cao (dưới 40 °C). Phổi viêm đối xứng, viêm từ thùy tim sang thùy đỉnh ở phía trước và thùy hoành ở phía sau. Phổi bị viêm lúc đầu có màu đỏ, sau chuyển sang thâm, bề mặt bóng, bên trong có chất keo, tiếp sau phổi chắc lại như miếng thịt (phổi bị nhục hóa).

...

...

...

6.3.2  Chẩn đoán phân biệt bệnh tụ huyết trùng với một số bệnh khác ở trâu, bò

- Bệnh nhiệt thán: Do vi khuẩn Bacillus anthracis gây ra. Trâu, bò sốt cao (có thể lên tới 42 °C), có triệu chứng thần kinh và chết nhanh. Khi chết, xác chết phình to, các lỗ tự nhiên chảy máu thâm đen, không đông. Lách sưng to, dễ nát.

- Bệnh ung khí thán: Do vi khuẩn Clostridium chauvoei gây ra. Trâu, bò sốt (thường dưới 40 °C). Trên các bắp thịt ở cổ, vai, bắp chân, đùi, mông có các khối sưng (ung) nếu ấn tay thấy lõm và có các tiếng lạo xạo. Cắt ở chỗ có ung, thấy có chất keo lầy nhầy, có thấy sùi bọt, có tiếng lạo xạo, phần cơ có màu thâm đen.

6.3.3  Chẩn đoán phân biệt bệnh tụ huyết trùng với một số bệnh khác ở gia cầm

- Bệnh Newcastle: Do giống Avulavirus, thuộc họ Paramyxoviridae gây ra. Gia cầm bỏ ăn, lông xù, có thể bị liệt chân, liệt cánh (cánh xã như khoác áo tơi), mũi chảy dịch nhớt màu đỏ xám, vươn cổ há mỏ để thở, mào và tích sưng phù, có màu tím sẫm. Khí quản chứa nhiều dịch viêm, niêm mạc viêm cata. Phổi sưng to, xuất huyết. Dạ dày cơ, dạ dày tuyến, lớp mỡ vành tim xuất huyết.

- Bệnh cúm gia cầm độc lực cao: Do vi rút Influenza typ A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Mào và tích gia cầm sưng, thâm tím. Phân thường loãng, có màu trắng, xanh, vàng. Niêm mạc khí quản có dịch nhày lẫn máu. Phổi xung huyết, tụ huyết nặng. Tim, gan, lách, thận xuất huyết, dạ dày, niêm mạc đường tiêu hóa xuất huyết.

- Bệnh phù đầu gà (Coryza): Do vi khuẩn Avibacterium paragallinarum gây ra. Đây là bệnh truyền nhiễm đường hô hấp cấp tính ở gà với các đặc trưng là chảy nước mũi, kết mạc mắt bị viêm cata, túi khí viêm, mặt và tích sưng phù dưới da.

- Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm: Do vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây ra. Triệu chứng đầu tiên là thủy cầm bị tiêu chảy, chảy nước mắt, nước mũi, hít thở khó khăn, có ho nhẹ, đi lại khó khăn, kéo lê chân hoặc không đi lại được. Thủy cầm mất cân bằng, sưng phù đầu, nghoẹo cổ, đầu và cổ bị run, dễ bị kích thích bởi tiếng động, hai chân duỗi ra như bơi. Bệnh tích đặc trưng là viêm tơ huyết thành màng ở các cơ quan nội tạng.

7  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

...

...

7.1.1  Lấy mẫu

Đối với động vật nghi mắc bệnh còn sống lấy mẫu là dịch tiết đường hô hấp trên hoặc mẫu máu có chất chống đông.

- Lấy mẫu dịch tiết đường hô hấp trên: Dùng tăm bông (5.17) lấy dịch mũi hoặc dịch hầu họng, cho tăm bông vào ống nghiệm (5.13) có chứa dung dịch nước muối sinh lý (4.11), đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

- Mẫu máu có chất chống đông: Sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn 70 %, dùng bơm tiêm (5.11) và kim tiêm (5.12) lấy khoảng 1 ml đến 3 ml máu từ tĩnh mạch. Chuyển máu sang ống nghiệm đã có chất chống đông (4.13), trộn đều nhẹ nhàng trong 10 giây, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

Đối với động vật đã chết hoặc động vật nghi mắc bệnh cần mổ khám để kiểm tra bệnh tích, lấy mẫu bệnh phẩm được thực hiện theo TCVN 8402:2010 và hướng dẫn kỹ thuật về lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm động vật trên cạn. Bệnh phẩm bao gồm: Phổi, gan, lách, máu tim, dịch xoang bao tim, tủy xương.

- Lấy mẫu phổi, gan, lách: Dùng pank, kéo (5.9) cắt từ 10 g đến 100 g mỗi loại bệnh phẩm, để vào từng lọ hay túi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

- Lấy mẫu máu tim, dịch xoang bao tim: Dùng bơm tiêm (5.11) và kim tiêm (5.12) hoặc pipet (5.24) để hút lấy máu tim, dịch xoang bao tim. Để mẫu trong bơm tiêm hoặc chuyển sang lọ vô trùng riêng biệt, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

- Tủy xương: Xương ống đã được róc bỏ phần thịt, để vào từng túi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu.

7.1.2  Bảo quản mẫu

...

...

...

CHÚ THÍCH: Tất cả các mẫu phải được dán nhãn, ghi mã kí hiệu, gửi kèm theo phiếu gửi mẫu bệnh phẩm và các thông tin dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của ca bệnh.

7.2  Chuẩn bị mẫu, nuôi cấy và phân lập P. multocida

7.2.1  Chuẩn bị mẫu và nuôi cấy P. multocida

- Mẫu là dịch tiết đường hô hấp trên: Ống nghiệm đã có tăm bông lấy mẫu (xem 7.1.1) được lắc kỹ bằng máy lắc (5.23). Dùng pipet (5.24) hoặc dùng que cấy (5.15) lấy từ 5 μl đến 10 μl dung dịch mẫu nhỏ lên bề mặt môi trường thạch máu (4.4), môi trường thạch MacConkey (4.6), môi trường BHI (4.3). Dùng que cấy (5.15) ria cấy chỗ đã nhỏ bệnh phẩm lên các môi trường thạch;

- Mẫu là máu có chất chống đông, dịch xoang bao tim: Dùng pipet (5.24) hoặc dùng que cấy (5.15) lấy máu hoặc dịch xoang bao tim phết lên bề mặt môi trường thạch máu (4.4), môi trường thạch MacConkey (4.6) và cho vào môi trường BHI (4.3). Dùng que cấy (5.15) ria cấy chỗ đã phết bệnh phẩm lên các môi trường thạch;

- Mẫu là phổi, gan, lách: Sát trùng bề mặt ngoài của mẫu bằng bông cồn (5.16), rồi dùng pank, kéo (5.9) cắt sâu vào tổ chức bên trong lấy một mẫu nhỏ. Dùng pank (5.9) kẹp lấy mẫu bệnh phẩm vừa cắt phết lên bề mặt môi trường thạch máu (4.4), môi trường thạch MacConkey (4.6) và cho mẫu phổi, gan, lách vào môi trường BHI (4.3). Dùng que cấy (5.15) ria cấy chỗ đã phết bệnh phẩm lên các môi trường thạch;

- Mẫu là tủy xương: Dùng cưa, kìm (5.19) cắt phần đầu của xương ống để bộc lộ phần tủy đỏ. Dùng pank, kéo (5.9) để lấy phần tủy đỏ để phết lên bề mặt môi trường thạch máu (4.4), môi trường thạch MacConkey (4.6) và cho vào môi trường BHI (4.3). Dùng que cấy (5.15) ria cấy chỗ đã phết bệnh phẩm lên các môi trường thạch;

Ủ các đĩa và ống môi trường đã cấy mẫu vào trong tủ ấm (5.1). Kiểm tra kết quả sau 18 h đến 24 h.

7.2.2  Phân lập P. multocida

...

...

...

- Trong môi trường BHI đã nuôi cấy vi khuẩn (7.2.1): P. multocida mọc làm môi trường đục, lắc có vẩn nhẹ (như sương mù), môi trường không có cặn ở đáy;

- Trên thạch máu đã nuôi cấy vi khuẩn (7.2.1): Khuẩn lạc P. multocida không gây dung huyết, có mùi tanh, có 3 dạng: dạng M (Mucous) - dạng nhầy, ướt, có kích thước to nhất, có màu trắng hơi xám; dạng S (Smooth) - dạng trơn, có kích thước nhỏ, bóng, rìa nhẵn, mặt hơi vồng; dạng R (Rough) - khuẩn lạc thường dẹt, xù xì;

- Trên thạch MacConkey đã nuôi cấy vi khuẩn (7.2.1): P. multocida không mọc;

Chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường BHI (4.3) hoặc thạch máu (4.4) nuôi trong tủ ấm (xem 5.1) để xác định P. multocida.

7.3  Xác định hình thái của P. multocida

7.3.1  Nguyên tắc xác định hình thái của vi khuẩn

Vi khuẩn bắt màu Gram dương hay Gram âm là do sự khác nhau về thành phần và cấu trúc vách của tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dầy, nhiều axit teichoic và lipid nên không bị cồn tẩy màu, giữ nguyên màu tím. Vi khuẩn Gram âm có một lớp peptidoglydocan gắn với lớp phospholipit kép, xen kẽ các protein ở màng ngoài, lớp màng này dễ bị phá hủy bởi cồn khi tẩy màu, do đó phức hợp tím tinh thể - iốt không bền, bị tẩy màu và được thay bằng bằng màu hồng của thuốc nhuộm fuchsin.

7.3.2  Xác định hình thái P. multocida từ bệnh phẩm

Cách làm tiêu bản:

...

...

...

- Từ bệnh phẩm (phổi, gan, lách, tủy xương): Cắt một miếng nhỏ bệnh phẩm, phết mỏng trên phiến kính (5.18), để khô.

Tiêu bản đã được để khô, nhỏ cồn methanol ngập tiêu bản, để khô.

Sau đó tiêu bản được nhuộm theo phương pháp nhuộm Gram (xem Phụ lục A.1); Hoặc phương pháp nhuộm Giemsa (xem Phụ lục A.2);

Đọc kết quả nhuộm:

- Nhuộm Gram: P. multocida bắt màu hồng (màu của Gram âm), đa hình thái (cầu khuẩn, trực khuẩn, cầu trực khuẩn), lưỡng cực (hai đầu đậm hơn).

- Nhuộm Giemsa: P. multocida bắt màu xanh tím, đa hình thái, lưỡng cực.

7.3.3  Xác định hình thái P. multocida từ canh khuẩn, khuẩn lạc

Từ canh khuẩn (môi trường BHI đã nuôi cấy vi khuẩn) hoặc khuẩn lạc nghi ngờ là P. multocida (xem 7.2.2) tiến hành làm tiêu bản:

- Từ khuẩn lạc: Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý (4.11) lên phiến kính (5.18), dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc hòa đều vào giọt nước muối sinh lý.

...

...

...

Tiêu bản được để khô và cố định trên ngọn lửa đèn cồn khoảng từ 3 giây đến 5 giây;

Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Gram (xem Phụ lục A.1);

Đọc kết quả nhuộm Gram: P. multocida bắt màu hồng (màu của Gram âm), đa hình thái (cầu khuẩn, trực khuẩn, cầu trực khuẩn).

LƯU Ý: Việc xác định hình thái của vi khuẩn bằng kính hiển vi chỉ là nhận định ban đầu, chưa thể xác định được vi khuẩn. Cần xác định vi khuẩn bằng các phương pháp khác như các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn, phương pháp PCR, LAMP, Realtime PCR, ngưng kết.

7.4  Xác định P. multocida bằng phản ứng sinh hóa

Từ canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi ngờ là P. multocida (xem 7.2.2) tiến hành xác định một số đặc tính sinh hóa đặc trưng được nêu trong Bảng 1.

Môi trường xác định các đặc tính sinh hóa của P. multocida và cách tiến hành các phản ứng được nêu trong Phụ lục C.

Xác định đặc tính sinh hóa của P. multocida có thể sử dụng kít thương mại hoặc máy định danh vi khuẩn. Quy trình tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 1 - Một số đặc tính sinh hóa đặc trưng của P. multocida

...

...

...

Đặc tính sinh hóa của P. multocida

Lên men đường glucose

Dương tính

Lên men đường lactose

Âm tính

Lên men đường mannitol

Dương tính

Di động

Âm tính

...

...

...

Âm tính

Sinh indol

Dương tính

Phân giải urease

Âm tính

Phản ứng catalase

Dương tính

Phản ứng oxidase

Dương tính

...

...

...

7.5.1  Chuẩn bị mẫu

- Với mẫu bệnh phẩm là dịch đường hô hấp trên: Ống nghiệm đã có tăm bông lấy mẫu (xem 7.1.1) được lắc kỹ bằng máy lắc (5.23). Dùng pipet (5.24) lấy 200 μl dung dịch mẫu cho vào ống ly tâm 1,5 ml để tách chiết ADN của vi khuẩn;

- Với mẫu bệnh phẩm là máu có chất chống đông hoặc dịch xoang bao tim: Dùng pipet (5.24) lấy 200 μl mẫu cho vào ống ly tâm 1,5 ml để tách chiết ADN của vi khuẩn;

- Với mẫu bệnh phẩm là phổi, gan, lách, tủy xương: Đồng nhất mẫu bằng cách dùng pank kéo (5.9) cắt nhỏ và nghiền mẫu bệnh phẩm với nước muối sinh lý (4.11) theo tỉ lệ 1 : 9 (phần thể tích) bằng cối chày sứ (5.20) hoặc bằng máy nghiền mẫu, máy dập mẫu. Chuyển huyễn dịch bệnh phẩm vừa đồng nhất vào ống ly tâm và ly tâm với gia tốc 1.500 g trong 10 min, loại bỏ cặn thu lấy dịch nổi phía trên vào ống 1,5 ml để tách chiết ADN của vi khuẩn;

Với khuẩn lạc nghi ngờ là P. multocida, lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 200 μl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water); Với canh khuẩn thì lấy 200 μI để tách chiết ADN của vi khuẩn.

7.5.2  Tách chiết ADN

Tách chiết ADN từ bệnh phẩm hoặc vi khuẩn nghi ngờ bằng kít thương mại. Quy trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít tách chiết ADN của hãng Qiagen (DNeasy Blood & Tissue Kit, Catalog number: 69504); Kít tách chiết ADN của hãng Invitrogen (PureLink™ Genomic DNA Mini Kit, Catalog number: K182002).

Với vi khuẩn hay canh khuẩn nghi ngờ là P. multocida có thể tách chiết ADN của vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt (xem Phụ lục D.2).

...

...

...

Xác định P. multocida bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu được nêu trong bảng 2.

Bảng 2 - Cặp mồi xác định P. multocida ^[1,7]

Gen đích

Tên mồi

Trình tự từ đầu 5’ tới 3’

Kích thước sản phẩm (bp)

KMT1

KMT1T7

ATCCGCTATTTACCCAGTGG

...

...

...

KMT1SP6

GCTGTAAACGAACTCGCCAC

[1] OIE, 2021. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 3.4.10: Heamorrhagic septiceamia;

[7] Development of PCR assays for species and type specific identification of Pasteurella multocida isolates.

Chuẩn bị mẫu, các bước tiến hành phản ứng PCR, chu trình nhiệt của phản ứng PCR được quy định tại Phụ lục D

7.5.4  Đọc kết quả

Mẫu kiểm tra dương tính khi có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương (kích cỡ sản phẩm 460 bp);

Mẫu kiểm tra âm tính khi không có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương.

7.6  Xác định P. multocida bằng phương pháp Realtime PCR

...

...

...

Xem 7.5.1.

7.6.2  Tách chiết ADN

Xem 7.5.2.

7.6.3   Tiến hành

Xác định P. multocida bằng phương pháp Realtime PCR với cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu được nêu trong bảng 3.

Bảng 3 - Cặp mồi và mẫu dò xác định P. multocida ^[2]

Tên mồi

Trình tự từ đầu 5’ tới 3’

PMA2f

...

...

...

PMA2r

GGTCCCACCCTTT(A/C)CTCCTC

Mẫu dò MGB PMA2

6 FAM - CCGCGTA(A/T)TCTCT - MGBNFQ

[2] OIE, 2021. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 3.3.9: Fowl Cholera

Chuẩn bị mẫu, các bước tiến hành phản ứng Realtime PCR, chu trình nhiệt của phản ứng Realtime PCR được quy định tại Phụ lục E.

7.6.4  Đọc kết quả

Xem Phụ lục E.5.

7.7  Xác định P. multocida bằng phương pháp LAMP

...

...

...

Xem 7.5.1.

7.7.2  Tách chiết ADN

Xem 7.5.2.

7.7.3  Tiến hành

Xác định P. multocida bằng phương pháp LAMP với cặp mồi đặc hiệu được nêu trong bảng 4.

Bảng 4 - Trình tự các cặp mồi cho phản ứng LAMP ^[9]

TT

Gen đích

Trình tự từ đầu 5’ tới 3’

...

...

...

F3

GGTGCCTATCTTGCTTCG

B3

TCGATCGCTAGCACCACA

2

FIP (F1c+F2)

TGCCGTAGCAGAAACTGGAC+AGGTGAGCCATGTGAGCT

BIP (B2+B1c)

CACACCGAAGCCAGGACTT+CACCAAATGTACTGGTTGCTTC

...

...

...

Loop F

CGACCATCGGTTGCATTTC

Loop B

TGGCATTGCATGGCTATCA

[9] Loop-mediated Isothermal Amplification assay (LAMP) based detection of Pasteurella multocida in cases of haemorrhagic septicaemia and fowl cholera

CHÚ THÍCH: dấu (+) được thay bằng trình tự TTTT khi thiết kế mồi để nối giữa trình tự F1c và F2 (trong mồi FIP), nối trình tự B2 và B1c (trong mồi BIP).

Chuẩn bị mẫu, các bước tiến hành phản ứng LAMP, chu trình nhiệt của phản ứng và đọc kết quả được quy định tại Phụ lục F.

7.7.4  Đọc kết quả

Kết quả của phản ứng LAMP có thể đọc bằng mắt ở điều kiện ánh sáng bình thường dựa vào sự thay đổi màu của dung dịch trong ống phản ứng:

...

...

...

+ Mẫu kiểm tra âm tính: Ống mẫu không thay đổi màu, có mẫu giống đối chứng âm.

Kết quả của phản ứng LAMP có thể đọc bằng đèn tia cực tím (đèn UV) hoặc điện di (Xem Phụ lục F.5).

7.8  Xác định typ huyết thanh của P. multocida bằng phương pháp PCR

7.8.1  Chuẩn bị mẫu

Xem 7.5.1.

7.8.2  Tách chiết ADN

Xem 7.5.2.

7.8.3  Tiến hành

Xác định P. multocida thuộc typ A hoặc typ B bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu được nêu trong bảng G.1.

...

...

...

7.8.4  Đọc kết quả

Xem Phụ lục G.6.

Mẫu kiểm tra dương tính với P. multocida typ A khi kết quả PCR có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương (sản phẩm là 564 bp) hoặc mẫu kiểm tra dương tính với P. multocida typ B khi kết quả PCR có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương (sản phẩm là 620 bp).

Mẫu kiểm tra âm tính khi không có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương.

7.9  Xác định P. multocida bằng phương pháp ngưng kết

7.9.1  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra: canh khuẩn, khuẩn lạc nghi ngờ là P. multocida (xem 7.2.2).

Mẫu đối chứng dương: là kháng nguyên chuẩn (xem H.2.2).

Mẫu đối chứng âm (xem H.2.3).

...

...

...

Xem Phụ lục H.

7.9.3  Đọc kết quả

Mẫu kiểm tra dương tính: có xuất hiện các hạt ngưng kết lấm tấm.

Mẫu kiểm tra âm tính: không xuất hiện hạt ngưng kết.

8  Kết luận

Lợn, trâu, bò, gia cầm được kết luận mắc bệnh tụ huyết trùng khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và một trong số các kết quả sau đây:

- Phân lập, xác định hình thái (xem 7.3) và xác định được vi khuẩn bằng các phản ứng sinh hóa (xem 7.4);

- Kết quả xét nghiệm PCR dương tính với P. multocida (xem 7.5);

- Kết quả xét nghiệm Realtime PCR dương tính với P. multocida (xem 7.6);

...

...

...

- Kết quả xét nghiệm PCR dương tính với P. multocida typ A hoặc typ B (xem 7.8);

- Kết quả xét nghiệm ngưng kết dương tính với P. multocida (xem 7.9).

Phụ lục A

(Quy định)

Các phương pháp nhuộm P. multocida

A.1  Phương pháp nhuộm Gram

A.1.1  Thuốc thử

A.1.1.1  Dung dịch tím tinh thể

...

...

...

2,0 g

Etanol 95 % (thể tích)

20,0 ml

Amoni oxalat [(NH₄)₂C₂O₄.2H₂O]

0,8 g

Nước cất

80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.1.2  Dung dịch fuchsin đậm đặc

...

...

...

1 g

Etanol 95 % (thể tích)

10 ml

Phenol (C₆H₆O)

5 g

Nước cất

100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch fuchsin đậm đặc với nước theo tỉ lệ 1 : 10 (thể tích).

A.1.1.3  Dung dịch lugol

...

...

...

2 g

Iốt (I2) tinh thể

1 g

Nước cất

200 ml

Nghiền kali iodua và iốt tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.1.4  Cồn axeton

Etanol 95 % (thể tích)

3 phần

...

...

...

1 phần

A.1.2  Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản, để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ cồn axeton, rửa nước thật nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc để khô.

A.1.3  Soi tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và soi tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (5.2).

A.2  Phương pháp nhuộm Giemsa

...

...

...

A.2.1.1  Dung dịch Giemsa đậm đặc

Giemsa (dạng bột)

1,0 g

Glyxerin [C₃H₅(OH)₃]

66 ml

Cồn metanol nguyên chất

66 ml

Làm nóng glyxerin trong bể điều nhiệt (5.10). Thêm thuốc nhuộm Giemsa trộn đều và ủ trong 2 h. Sau đó để nguội và thêm cồn methanol và giữ trong khoảng 2 tuần trước khi sử dụng.

Khi sử dụng pha loãng theo tỷ lệ 1:10 (thể tích) trong dung dịch đệm phosphate 0,01 M (pH = 7,0) và giữ trong 30 min.

...

...

...

Dung dịch natri hydrophotphat (Na₂HPO₄)

9,47 g

Dung dịch kali dihydrophotphat (KH₂PO₄)

9,08 g

Nước cất

900 ml

Hòa tan natri hydrophotphat, kali dihydrophotphat trong nước và lắc cho tan hết.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thuốc nhuộm Giemsa thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2.2  Cách tiến hành

...

...

...

Nhỏ dung dịch Giemsa ngập tiêu bản, để từ 20 min đến 30 min, rồi rửa nhanh với nước và sấy khô.

A.2.3  Soi tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và soi tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (5.2).

Phụ lục B

(Quy định)

Môi trường nuôi cấy P. multocida

B.1  Môi trường BHI

B.1.1  Nguyên liệu

...

...

...

Môi trường BHI ^(*)

3,7 g

Nước cất vừa đủ

100 ml

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

VÍ DỤ: (*) dùng môi trường BHI (Brain Heart infusion) của hãng Merck (Cat. No. 110493) 1), thành phần cho môi trường BHI
được nêu ở mục B.1.1.

LƯU Ý: Môi trường BHI nuôi cấy vi khuẩn Pasteurella multocida có thể bổ sung 5 % huyết thanh vô trùng, tạo điều kiện cho vi
khuẩn mọc tốt hơn.

B.1.2  Cách tiến hành

...

...

...

Vô trùng môi trường BHI ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (xem 5.3).

Lắc đều và chia ra ống nghiệm (5.13) khoảng 5 ml / ống.

Kiểm tra vô trùng môi trường.

Bảo quản môi trường ở điều kiện khoảng từ 4 °C đến 8 °C.

B.2  Môi trường thạch máu

B.2.1  Nguyên liệu

Thành phần:

Thạch máu cơ bản ^(**)

4 g

...

...

...

100 ml

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

VÍ DỤ: (**) dùng môi trường thạch máu cơ bản (Blood agar base) của hãng Merck (Cat. No. 110886) 2⁾, thành phần cho môi trường thạch máu bổ sung được nêu ở mục B.2.1.

LƯU Ý: Môi trường thạch máu nuôi cấy vi khuẩn Pasteurella multocida có thể bổ sung 5 % huyết thanh vô trùng, tạo điều kiện cho vi khuẩn mọc tốt hơn.

B.2.2  Cách tiến hành

Chuẩn bị môi trường thạch máu cơ bản (**) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Vô trùng môi trường thạch máu ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (xem 5.3).

Đợi nhiệt độ của môi trường thạch máu cơ bản đã vô trùng khoảng 40 °C thì bổ sung máu (4.5).

Lắc đều và chia ra đĩa petri (5.14) khoảng 20 ml / đĩa.

...

...

...

Bảo quản môi trường ở điều kiện khoảng từ 4 °C đến 8 °C.

B.3  Môi trường thạch MacConkey

B.3.1  Nguyên liệu

Thành phần:

Môi trường thạch MacConkey^(***)

5 g

Nước cất vừa đủ

100 ml

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

...

...

...

B.3.2  Cách tiến hành

Chuẩn bị môi trường thạch MacConkey ^(***) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Vô trùng môi trường thạch MacConkey ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (xem 5.3).

Lắc đều, để môi trường nguội xuống khoảng 40 °C, chia ra đĩa petri (5.14) khoảng 20 ml / đĩa.

Kiểm tra vô trùng môi trường.

Bảo quản môi trường ở điều kiện khoảng từ 4 °C đến 8 °C.

Phụ lục C

(Quy định)

...

...

...

C.1  Môi trường và thuốc thử

C.1.1  Môi trường thạch Kligler hoặc thạch TSI (Triple Sugar Iron agar)

Thành phần:

Peptone

15 g

Lactose

10 g

Proteose peptone

5 g

...

...

...

5 g

Chất chiết thịt bò

3 g

Cao nấm men

3 g

Dextrose

1 g

Sodium thiosulfate

0,3 g

...

...

...

0,024 g

Agar

12 g

Nước cất

1000 ml

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

VÍ DỤ: dùng môi trường thạch Kligler của hãng Merck (Cat. No. 103913) 4)

Cách tiến hành:

...

...

...

Vô trùng môi trường ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (5.3).

Lắc đều và chia ra ống nghiệm (5.13) khoảng 10 ml / ống.

Đặt ống môi trường nghiêng để được 2 phần. Phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng lên men đường glucose, sinh hơi, sinh H₂S, phần thạch nghiêng để kiểm tra khả năng lên men đường lactose.

Kiểm tra vô trùng môi trường. Bảo quản môi trường ở điều kiện khoảng từ 4 °C đến 8 °C.

C.1.2  Môi trường thạch bán lỏng mannitol

Thành phần:

Pepton

10 g

Mannitol

...

...

...

KNO3

1,7 g

Agar

2,5 g

Đỏ phenol 0,2 %

20 ml

Nước cất

1000 ml

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

...

...

...

Hòa tan các thành phần trên và đun sôi cho tan hoàn toàn.

Chia ra các ống nghiệm (5.13), khoảng 6 ml /1 ống nghiệm.

Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (5.3) ở 115 °C trong 20 min.

Kiểm tra vô trùng môi trường. Bảo quản môi trường ở điều kiện khoảng từ 4 °C đến 8 °C.

C.1.3  Môi trường thạch urê

Thành phần dung dịch urê 40 %:

Urê

40 g

Nước cất

...

...

...

Thành phần thạch urê cơ bản:

Peptone

1 g

Glucose

1 g

NaCl

5 g

Na₂HPO₄

1,2 g

...

...

...

0,8 g

Đỏ phenol

0,012 g

Agar

15 g

Nước cất

950 ml

Chỉnh pH = 6,8 ± 0,2 ở 25 °C

Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (urea agar base - Christensen). Pha chế môi trường và bổ sung urê theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

Cách tiến hành:

Lấy 40 g urê hòa tan trong 100 ml nước cất. Tiệt trùng dung dịch urê bằng cách lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm.

Hòa tan các thành phần của thạch urê cơ bản và đun sôi cho tan hoàn toàn. Sau đó hấp tiệt trùng trong nồi hấp (5.3) ở 115 °C trong 20 min.

Thạch urê cơ bản đã tiệt trùng, để nguội khoảng 40 °C sẽ được bổ sung với 50 ml dung dịch urê 40%.

Lắc đều và chia ra các ống nghiệm (5.13), khoảng 6 ml /1 ống nghiệm.

Kiểm tra vô trùng môi trường. Bảo quản môi trường ở điều kiện khoảng từ 4 °C đến 8 °C.

C.1.4  Môi trường nước pepton

Thành phần:

Peptone ^(*)

...

...

...

Nước cất vừa đủ

100 ml

Chỉnh pH = 6,8 ± 0,2 ở 25 °C

VÍ DỤ: (*) dùng môi trường Peptone của hãng Merck (Cat. No. 107228) 6)

Cách tiến hành:

Chuẩn bị môi trường nước pepton theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Vô trùng môi trường nước pepton ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (5.3).

Lắc đều và chia ra ống nghiệm (5.13) khoảng 5 ml / ống.

Kiểm tra vô trùng môi trường. Bảo quản môi trường ở điều kiện khoảng từ 4 °C đến 8 °C.

...

...

...

Thành phần:

Paradimetyl aminobenzaldehyt

5 g

Cồn amylic (C₅H₁₁OH)

75 ml

Axit clohydric đặc

25 ml

Cách tiến hành:

Trộn dung dịch paradimetyl aminobenzaldehyt vào cồn amylic cho tan hết và để trong tủ lạnh 4 °C. Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml HCl, trộn đều rồi để tủ lạnh, sau đó lại tiếp tục bổ sung HCl.

...

...

...

CHÚ THÍCH: có thể sử dụng thuốc thử Kovac’s thương mại và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng thuốc thử Kovac's của hãng Merck (Cat. No. 109293)

C.1.6  Thuốc thử H₂O₂ 3 % (thể tích)

C.1.7  Thuốc thử oxidase hoặc giấy lọc tẩm 1 % tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride

C.2  Cách tiến hành

C.2.1  Kiểm tra đặc tính lên men đường glucose, đường lactose, sinh H₂S trên môi trường thạch Kligler hoặc TSI

Cách tiến hành:

Dùng que cấy chích sâu (5.15) lấy khuẩn lạc cấy thẳng (chính giữa phần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm môi trường thạch Kligler hoặc thạch TSI (xem điều C.1.1 Phụ lục C).

Nuôi trong tủ ấm (5.1), sau 24 h đọc kết quả:

...

...

...

- Phản ứng dương tính: Phần đứng của môi trường thạch chuyển sang màu vàng;

- Phản ứng âm tính: Phần đứng của môi trường thạch không chuyển màu.

Lên men đường lactose:

- Phản ứng dương tính: Phần nghiêng của môi trường thạch chuyển sang màu vàng;

- Phản ứng âm tính: Phần nghiêng của môi trường thạch không chuyển màu.

Khả năng sinh H₂S:

- Phản ứng dương tính: Đáy ống nghiệm có màu đen;

- Phản ứng âm tính: Đáy ống nghiệm không có màu đen.

C.2.2  Kiểm tra đặc tính lên men đường mannitol và khả năng di động của vi khuẩn trên môi trường thạch mannitol bán lỏng

...

...

...

Dùng que cấy chích sâu (5.15) lấy khuẩn lạc cấy thẳng xuống gần đáy của ống nghiệm có môi trường thạch lỏng (xem điều C.1.2 Phụ lục C).

Nuôi trong tủ ấm (5.1), đọc kết quả sau 24 h:

Lên men đường mannitol:

- Phản ứng dương tính: Môi trường thạch chuyển sang màu vàng;

- Phản ứng âm tính: Môi trường thạch không chuyển màu.

Khả năng di động của vi khuẩn:

- Phản ứng dương tính (có khả năng di động): Môi trường đục, không nhìn rõ đường cấy chích sâu;

- Phản ứng âm tính: Môi trường trong và nhìn thấy đường cấy chích sâu.

C.2.3  Kiểm tra khả năng phân giải urê

...

...

...

Dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường thạch urê (xem điều C.1.3 Phụ lục C).

Nuôi trong tủ ấm (5.1), đọc kết quả sau 24 h:

- Phản ứng dương tính: Môi trường chuyền sang màu hồng;

- Phản ứng âm tính: Môi trường không chuyển màu.

C.2.4  Kiểm tra khả năng sinh indol

Cách tiến hành:

Dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường nước pepton (xem điều C.1.4 Phụ lục C).

Nuôi trong tủ ấm (5.1)

Sau 24 h nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ.

...

...

...

- Phản ứng dương tính (sinh indol): Xuất hiện vòng màu đỏ phía trên môi trường.

- Phản ứng âm tính (không sinh indol): Không xuất hiện vòng màu đỏ.

C.2.5  Phản ứng catalase

Cách tiến hành:

Nhỏ một giọt thuốc thử H₂O₂ 3 % lên phiến kính (5.18).

Dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cho vào giọt thuốc thử H₂O₂ đã nhỏ trên phiến kính.

Đọc kết quả sau 5 s:

- Phản ứng dương tính: Có hiện tượng sủi bọt;

- Phản ứng âm tính: Không có hiện tượng sủi bọt.

...

...

...

Cách tiến hành:

Dùng giấy lọc đã tẩm 1 % tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride hoặc nhỏ một giọt thuốc thử oxidase lên giấy lọc.

Dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc nghi ngờ phết vào phần giấy lọc đã có thuốc thử.

Đọc kết quả sau 20 s:

- Phản ứng dương tính: Chỗ phết khuẩn lạc trên giấy lọc có màu tím;

- Phản ứng âm tính: Chỗ phết khuẩn lạc trên giấy lọc không chuyển màu.

Phụ lục D

(Quy định)

...

...

...

D.1  Nguyên liệu PCR

D.1.1  Taq PCR Master Mix Kit;

Ví DỤ: Dùng kít nhân gen Taq PCR Mastermix kit Qiagen (Cat. No. 201443); Thermo Scientific Dream Taq PCR Mastermix (2X) (Cat. No. K1071)

D.1.2  Cặp mồi (primers): mồi xuôi (KMT1T7) và mồi ngược (KMT1SP6) (Bảng 2);

D.1.3  Nước tinh khiết không có nuclease;

D.1.4  Dung dịch đệm điện di: Có thể dùng dung dịch đệm TAE hoặc TBE;

D.1.5  Chất nhuộm màu ADN;

VÍ DỤ: Chất nhuộm màu SYBR safe ADN gel stain của hãng Invitrogen; hoặc chất nhuộm màu Gel Red của hãng Biotium.

KHUYẾN CÁO: Chất nhuộm màu Ethidi bromua có thể gây ung thư nên khuyến cáo không sử dụng.

...

...

...

D.1.7  ADN (Acid Deoxyribo Nucleic) chuẩn (Ladder, marker), thang 100 bp;

D.1.8  Dung dịch đệm TE.

D.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra: Là bệnh phẩm nghi mắc bệnh tụ huyết trùng (xem 7.1.1) hoặc là canh khuẩn, khuẩn lạc P. multocida nghi ngờ (xem 7.2.2).

Mẫu đối chứng dương: Là chủng vi khuẩn đã được xác định là P. multocida hoặc sử dụng các chủng P. multocida chuẩn.

Tách chiết ADN

- Tách chiết ADN của vi khuẩn P. multocida bằng kít thương mại: Các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít tách chiết ADN của hãng Qiagen (DNeasy Blood & Tissue Kit, Catalog number: 69504); Kít tách chiết ADN của hãng Invitrogen (PureLink™ Genomic DNA Mini Kit, Catalog number: K182002).

- Tách chiết ADN của vi khuẩn P. multocida bằng phương pháp sốc nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 μl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch bằng máy ly tâm (5.4) với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

...

...

...

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc: Mồi gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (5.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (D.1.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μM /μl làm mồi gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 μM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (D.1.3).

VÍ DỤ: lấy 20 μl mồi gốc có nồng độ 100 μM và thêm 80 uM nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 20 μM / μl.

D.4  Tiến hành

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (xem D.3). Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml.

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của Thermo Scientific Dream Taq PCR Mastermix (2X) (Cat, No. K1071) 7), thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng D.1.

Bảng D.1 - Thành phần của phản ứng PCR xác định P. multocida

...

...

...

Thể tích cho 01 phản ứng

(μl)

Thermo Scientific Dream Taq PCR Mastermix (2X)

12,5

Nước không có nuclease

6,5

Mồi xuôi (20 μM)

0,5

Mồi ngược (20 μM)

...

...

...

Tổng thể tích

20,0

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ADN của P. multocida vào ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

- Mẫu bệnh phẩm: Cho 5 μl mẫu ADN cần kiểm tra vào ống phản ứng.

LƯU Ý: Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy PCR (5.6) với chu trình nhiệt như nêu trong bảng D.2.

Bảng D.2 - Chu trình nhiệt xác định P. multocida

...

...

...

Thời gian

Số chu kỳ

95 °C

2 min

1 vòng

95 °C

30 s

35 vòng

55 °C

...

...

...

72 °C

1 min

72 °C

7 min

1 vòng

CHÚ THÍCH: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kít nhân gen. Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

D.5  Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE có bổ sung chất nhuộm màu (D.1.5). Cách pha chế thạch agarose và bổ sung chất nhuộm màu, sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 10 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl ADN chuẩn (marker) (D.1.7) vào một giếng.

...

...

...

D.6  Đọc kết quả

Phản ứng PCR được công nhận khi: ADN có dải vạch sáng rõ ràng; Mẫu đối chứng dương tính có một vạch duy nhất đúng kích cỡ sản phẩm (460 bp) và mẫu đối chứng âm không có vạch sản phẩm;

- Mẫu kiểm tra dương tính khi có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương (sản phẩm có kích cỡ 460 bp);

- Mẫu kiểm tra âm tính khi không có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương;

Phụ lục E

(Quy định)

Xác định P. multocida bằng phương pháp Realtime PCR

E.1  Nguyên liệu cho phương pháp Realtime PCR

...

...

...

VÍ DỤ: QuantiTect Probe PCR kit (Cat. No. 204343), Platinum™ Quantitative PCR SuperMix-UDG (Cat. No. 11730025);

E.1.2  Cặp mồi (primers) và mẫu dò: (xem bảng 3);

E.1.3  Nước tinh khiết không có nuclease;

E.1.4  Dung dịch đệm TE

E.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra: Là bệnh phẩm từ gia cầm nghị mắc bệnh tụ huyết trùng (xem 7.1.1) hoặc canh khuẩn, khuẩn lạc nghi ngờ là P. multocida (xem 7.2.2).

Mẫu đối chứng dương: Chủng vi khuẩn đã được xác định là P. multocida hoặc sử dụng các chủng P. multocida chuẩn.

Chuẩn bị mẫu: Xem Phụ lục D.2.

E.3  Chuẩn bị mồi và mẫu dò

...

...

...

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 μM, mẫu dò sử dụng ở nồng độ 20 μM được pha loãng từ mồi gốc, mẫu dò gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (E.1.3).

VÍ DỤ: lấy 20 μl mồi gốc có nồng độ 100 μM và thêm 80 μl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 20 μM / μl.

E.4  Tiến hành

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (xem E.3).

Phản ứng Realtime PCR sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit nhân gen QuantiTect Probe PCR kit, code: 204343

Bảng E.1 - Thành phần của phản ứng Realtime PCR

Thành phần

Thể tích cho 01 phản ứng

...

...

...

QuantiTect Probe PCR kit

12,5

Nước không có nuclease

6,8

Probe (20 μM)

0.3

Mồi xuôi (20 μM)

0,2

Mồi ngược (20 μM)

...

...

...

Tổng thể tích

20,0

Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml.

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 5 μl mẫu ADN có giá trị Ct đã biết trước vào ống phản ứng.

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

- Mẫu bệnh phẩm: Cho 5 μl mẫu AND vào ống phản ứng.

LƯU Ý: Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy Realtime PCR (5.5) theo đặt chu trình nhiệt nêu trong Bảng E.2.

...

...

...

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

95 °C

5 min

1 vòng

94 °C

10 s

40 vòng

...

...

...

20 s

62 °C

20 s

(*) Thời điểm ghi nhận tín hiệu huỳnh quang.

CHÚ THÍCH: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kít nhân gen. Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

E.5  Đọc kết quả

Đọc kết quả phản ứng bằng máy Reatime PCR dựa trên giá trị Ct (Ct - Cycle threshold, là thời điểm máy đọc Realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền).

Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu kiểm chứng dương tính có giá trị Ct biết trước (± 2 giá trị Ct), mẫu kiểm chứng âm tính không có Ct;

- Mẫu kiểm tra dương tính khi giá trị Ct ≤ 35;

...

...

...

- Mẫu kiểm tra nghi ngờ khi có giá trị 35 < Ct ≤ 40.

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc bằng phương pháp khác để khẳng định.

Phụ lục F

(Quy định)

Xác định P. multocida bằng phương pháp LAMP

Nguyên lý của phương pháp LAMP

Phản ứng LAMP muốn hoạt động cần có sự tham gia của 03 cặp mồi: cặp mồi trong (FIP và BIP), cặp mồi ngoài (F3 và B3) và cặp mồi vòng (LF và LB).

Cặp mồi trong (FIP - Forward inner primer và BIP - Backward inner primer) và cặp mồi ngoài (F3 và B3) được sử dụng để tạo sợi khởi đầu cho phản ứng LAMP. Hai cặp mồi này (4 mồi) được thiết kế dựa trên 6 vùng khác nhau của ADN đích: vùng F3c, F2c, F1c ở đầu 3’ và vùng B1, B2, B3 ở đầu 5’. Trình tự FIP và BIP được thiết kế như sau:

...

...

...

- BIP sẽ chứa trình tự B1c bổ sung cho B1, một đoạn TTTT và B2.

- Hai mồi ngoài B3 bổ sung cho đoạn B3c và trình tự F3 bổ sung cho F3c.

Cặp mồi Loop (LF - Loop Forward và LB - Loop Backward) được dùng cho giai đoạn sau của quá trình khuếch đại, quá trình tự mồi để làm tăng hiệu quả của phản ứng.

Kết quả của phản ứng LAMP là tạo ra nhiều cấu trúc ADN kép bao gồm các trình tự lặp đi lặp lại luân phiên đảo ngược trình tự đích được ngăn cách với nhau bởi các vòng lặp trong cùng một sợi trên một phân tử ADN kép.

F.1  Nguyên liệu của phương pháp LAMP

F.1.1  LAMP Master Mix Kit;

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen Bst DNA Polymerase, Large Fragment (Cat. No. M0275) của hãng New England Biolabs, Mỹ.

F.1.2  Các cặp mồi (xem bảng 4) và thành phần hỗn hợp các mồi cho phản ứng LAMP (xem bảng F.1);

F.1.3  Nước tinh khiết không có nuclease;

...

...

...

F.1.5  Chất chỉ thị màu huỳnh quang (xem bảng F.2).

F.2  Chuẩn bị mẫu

Xem Phụ lục D.2.

F.3  Chuẩn bị mồi và chất chỉ thị màu huỳnh quang

F.3.1  Chuẩn bị mồi

Chuẩn bị mồi gốc: Mồi gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (5.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (E.1.4) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μM /μl làm mồi gốc;

Mồi sử dụng cho phản ứng LAMP được chuẩn bị thành hỗn hợp mồi (xem bảng F.1). Nồng độ các mồi trong 25 μl thể tích phản ứng là: mồi FIP và BIP có nồng độ 20 μM /μl; mồi F3 và B3 có nồng độ 5 μM /μl; mồi Loop F và Loop B có nồng độ 10 μM /μl.

Bảng F.1 - Hỗn hợp mồi cho phản ứng LAMP

Thành phần

...

...

...

Thể tích cho 100 phản ứng (μl)

Mồi FIP (100 pmol)

5

50

Mồi BIP (100 pmol)

5

50

Mồi F3 (100 pmol)

1,25

...

...

...

Mồi B3 (100 pmol)

1,25

12,5

Mồi Loop F (100 pmol)

2,5

25

Mồi Loop B (100 pmol)

2,5

25

...

...

...

17,5

175

F.3.2  Chuẩn bị chất chỉ thị màu huỳnh quang

Tùy thuộc vào chất chỉ thị và chất huỳnh quang khác nhau sẽ có sự chuẩn bị tối ưu khác nhau.

VÍ DỤ: Chuẩn bị chất chỉ thị màu huỳnh quang sử dụng chất chỉ thị là Hydroxynapthol Blue và chất huỳnh quang là Sybr Green (xem bảng F.2)

Bảng F.2 - Chất chỉ thị màu huỳnh quang cho phản ứng LAMP

Thành phần của chất chỉ thị màu huỳnh quang

Cho 1000 phản ứng

Nước tinh khiết không có nuclease

...

...

...

Chỉ thị màu Hydroxynapthol Blue (100mM)

30 μl

Sybr Green (10.000X)

3 μl

F.4  Tiến hành

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen Bst DNA Polymerase, Large Fragment (Cat. No. M0275) của hãng New England Biolabs, Mỹ. Thành phần của phản ứng LAMP xác định P. multocida (xem bảng F.3)

Bảng F.3 - Thành phần của phản ứng LAMP

Thành phần

...

...

...

10X ThermoPol buffer

2,5

MgSO₄ (100 mM)

1,5

dNTP Mix (10mM)

3,5

Hỗn hợp mồi cho phản ứng LAMP (xem bảng F.1)

17,5

Bst DNA Polymerase, Large Fragment (8.000U/ml)

...

...

...

Nước không có nuclease

4,5

Chất chỉ thị và chất huỳnh quang (xem bảng F.2)

1

Tổng thể tích

20,0

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ADN của P. multocida vào ống phản ứng;

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng;

...

...

...

LƯU Ý: Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng LAMP bằng máy nhân gen (5.6) hoặc bể ổn nhiệt với chu trình nhiệt như nêu trong bảng F.4.

Bảng F.4 - Chu trình nhiệt xác định P. multocida

Nhiệt độ

Thời gian

65 °C

30 min

80 °C

5 min

...

...

...

Phản ứng LAMP có thể đọc kết quả bằng mắt ở điều kiện ánh sáng bình thường hoặc bằng đèn tia cực tím (đèn UV) hoặc điện di để kiểm tra sản phẩm của phản ứng.

F.5.1  Đọc kết quả bằng mắt ở điều kiện ánh sáng bình thường

Kết quả của phản ứng LAMP có thể đọc bằng mắt ở điều kiện ánh sáng bình thường dựa vào sự thay đổi màu của dung dịch trong ống phản ứng:

+ Mẫu kiểm tra dương tính: Ống mẫu thay đổi mầu, có mầu giống ống đối chứng dương (màu xanh);

+ Mẫu kiểm tra âm tính: Ống mẫu không thay đổi mầu, có mầu giống đối chứng âm (màu tím).

F.5.2  Đọc kết quả bằng đèn tia cực tím

Các ống của phản ứng LAMP được bổ sung chất nhuộm ADN. Kết quả của phản ứng được đọc bằng đèn tia cực tím và quan sát sự phát sáng trong ống phản ứng:

+ Mẫu kiểm tra dương tính: Ống mẫu có phát sáng và có màu giống ống đối chứng dương (màu xanh nếu sử dụng thuốc nhuộm ADN là SYBR green);

+ Mẫu kiểm tra âm tính: Ống mẫu không phát sáng, giống đối chứng âm.

...

...

...

Sản phẩm của phản ứng LAMP được điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 10 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl ADN chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được chạy điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch) ở bộ điện di (5.7) trong thời gian từ 20 min đến 30 min, ở 100 V.

Kết quả điện di: ADN chuẩn có dải gồm các vạch sáng rõ ràng;

+ Mẫu kiểm tra dương tính: Khi có nhiều vạch sản phẩm có kích thước khác nhau trên bản điện di, giống mẫu đối chứng dương;

+ Mẫu kiểm tra âm tính: Khi không có vạch sản phẩm, giống mẫu đối chứng âm.

Phụ lục G

(Quy định)

...

...

...

G.1  Nguyên liệu PCR

G.1.1  Taq PCR Master Mix Kit;

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen Taq PCR Mastermix kit Qiagen (Cat. No. 201443); Thermo Scientific Dream Taq PCR Mastermix (2X) (Cat. No. K1071)

G.1.2  Các cặp mồi (xem bảng G.1);

Bảng G.1 - Cặp mồi xác định typ P. multocida ^[1]

Typ

Tên mồi

Trình tự từ đầu 5’ tới 3’

Kích thước sản phẩm (bp)

...

...

...

RGPMA5

AATGTTTGCGATAGTCCGTTAGA

564

RGPMA6

ATTTGGCGCCATATCACAGTC

B

KTT72

AGGCTCGTTTGGATTATGAAG

620

...

...

...

ATCCGCTAACACACTCTC

[1] OIE, 2021. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 3.4.10: Heamorrhagic septiceamia

G.1.3  Nước tinh khiết không có nuclease;

G.1.4  Dung dịch đệm điện di: Có thể dùng dung dịch đệm TAE hoặc TBE;

G.1.5  Chất nhuộm màu ADN;

VÍ DỤ: Chất nhuộm màu SYBR safe ADN get stain của hãng Invitrogen; hoặc chất nhuộm màu Gel Red của hãng Biotium.

KHUYẾN CÁO: Chất nhuộm màu Ethidi bromua có thể gây ung thư nên khuyến cáo không sử dụng.

G.1.6  Loading dye (Đệm tải mẫu);

G.1.7  ADN (Acid Deoxyribo Nucleic) chuẩn (Ladder, marker), thang 100 bp;

...

...

...

G.2  Chuẩn bị mẫu

Xem Phụ lục D.2.

G.3  Chuẩn bị mồi

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc: Mồi gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (5.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (G.1.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μM /ul làm mồi gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 μM / μl: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (G.1.3).

VÍ DỤ: lấy 20 μl mồi gốc có nồng độ 100 μM và thêm 80 μl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 20 μM / μl.

G.4  Tiến hành

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (xem G.3). Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml.

...

...

...

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của Thermo Scientific Dream Taq PCR Mastermix (2X) (Cat. No. K1071) 8), thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng G.2.

Bảng G.2 - Thành phần của phản ứng PCR xác định typ P. multocida

Thành phần

Thể tích cho 01 phản ứng (μl)

Thermo Scientific Dream Taq PCR Mastermix (2X)

12,5

Nước không có nuclease

6,5

Mồi xuôi (20 μM)

...

...

...

Mồi ngược (20 μM)

0,5

Tổng thể tích

20,0

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ADN của P. multocida vào ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

- Mẫu bệnh phẩm: Cho 5 μl mẫu ADN cần kiểm tra vào ống phản ứng.

LƯU Ý: Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

...

...

...

Bảng G.3 - Chu trình nhiệt xác định typ P. multocida

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

95 °C

2 min

1 vòng

95 °C

30 s

...

...

...

55 °C

30 s

72 °C

1 min

72 °C

7 min

1 vòng

CHÚ THÍCH: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kít nhân gen. Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

G.5  Chạy điện di

...

...

...

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 10 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl ADN chuẩn (marker) (G.1.7) vào một giếng.

Bản thạch được chạy điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tủy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch) ở bộ điện di (5.7), trong thời gian từ 20 min đến 30 min, ở 100 V.

G.6  Đọc kết quả

Phản ứng PCR được công nhận khi: ADN có dải vạch sáng rõ ràng; Mẫu đối chứng dương tính có vạch đúng kích cỡ sản phẩm (của typ A là 564 bp, của typ B là 620 bp); mẫu đối chứng âm không có vạch sản phẩm;

Mẫu kiểm tra dương tính với P. multocida typ A khi kết quả PCR có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương (sản phẩm là 564 bp) hoặc mẫu kiểm tra dương tính với P. multocida typ B khi kết quả PCR có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương (sản phẩm là 620 bp).

Mẫu kiểm tra âm tính khi không có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương.

Phụ lục H

(Quy định)

...

...

...

LƯU Ý: Phương pháp ngưng kết áp dụng để xét nghiệm P. multocida gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò.

H.1  Nguyên lý của phương pháp ngưng kết

Là sự kết hợp giữa kháng nguyên hữu hình với kháng thể tương ứng, tạo thành các hạt ngưng kết mà mắt thường có thể quan sát được.

Phương pháp ngưng kết xác định P. multocida sử dụng kháng nguyên là P. multocida nghi ngờ và kháng thể chuẩn (xem H.2.1).

H.2  Nguyên liệu của phương pháp ngưng kết

H.2.1  Huyết thanh chuẩn (Kháng thể chuẩn): là huyết thanh được chế từ chủng P. multocida chuẩn chủng B2 (hoặc vi khuẩn đã được xác định là P. multocida gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò).

H.2.2  Mẫu đối chứng dương (Kháng nguyên chuẩn): là P. multocida chuẩn (hoặc vi khuẩn đã được xác định là P. multocida).

H.2.3  Mẫu đối chứng âm: là nước cất vô trùng.

H.2.4  Mẫu kiểm tra: Canh khuẩn, khuẩn lạc nghi ngờ là P. multocida (xem 7.2.2). Nếu mẫu kiểm tra là khuẩn lạc thì hòa với nước cất vô trùng, đảm bảo nồng độ vi khuẩn đạt 10⁸ đến 10⁹.

...

...

...

- Các nguyên liệu và mẫu xét nghiệm được để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 h trước khi làm phản ứng.

- Lắc nhẹ ống đựng kháng thể chuẩn (huyết thanh) để dung dịch trong ống được đồng nhất.

- Nhỏ 30 μl huyết thanh (xem H.2.1) lên trên phiến kính.

- Nhỏ 30 μl mẫu kiểm tra lên giọt huyết thanh đã có trên phiến kính

- Trộn đều mẫu kiểm tra với huyết thanh bằng que trộn.

- Lặp lại các bước trên với mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương.

- Lắc tròn nhẹ nhàng phiến kính trong 2 min (có thể sử dụng máy lắc).

- Đọc kết quả sau 2 min tính từ khi bắt đầu lắc.

LƯU Ý: chỉ đọc kết quả trong 2 min tính từ khi lắc phiến kính.

...

...

...

Mẫu kiểm tra dương tính: có xuất hiện các hạt ngưng kết lấm tấm.

Mẫu kiểm tra âm tính: không xuất hiện hạt ngưng kết.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE, 2021. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 3.4.10: Heamorrhagic septiceamia, p.1-16.

[2] OIE, 2021. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 3.3.9: Fowl Cholera, p.1-15.

[3] TCVN 8400-14 : 2011 - Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng trâu bò.

[4] TCVN 8400-31 : 2015 - Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng gia cầm.

[5] TCCS 36 : 2018/VT-CĐ - Quy trình chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng lợn.

...

...

...

[7] Towensend, K. M., Frost, A. J., Lee, C. W., Papadimitriou, J. M., Dawkins , J.S. 1998. Develoμment of PCR assays for species and type specific identification of Pasteurella multocida isolates . J. Clini. Micro. 36 (4): p.1096- 1100.

[8] Mayurkumar P. Bhimani, Bharat B. Bhanderi, Ashish Roy, 2015. Loop-mediated Isothermal Amplification assay (LAMP) based detection of Pasteurella multocida in cases of haemorrhagic septicaemia and fowl cholera. India Veterinary Microbiology, p.115-121.

[9] Carlos Pijoan, 2006. Diseases of swine. Chapter 43: Pneumonic Pasteumllosis. Blackwell Publish, the 9th Edition, p.719-726.

[10] John R. Glisson, Charles L. Hofacre and P. Christensen, 2008. Diseases of Poultry, Chapter 19: Pasteurellosis and other respiratory bacterial infections. Blackwell Publish, the 12th Edition, p.739-758.

[11] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy, Nguyễn Văn Giáp, Đặng Hữu Anh, Trương Hà Thái, Chu Thị Thanh Hương, 2020. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y. Phần 3.10: Bệnh tụ huyết trùng trâu bò, trang 196-202; Phần 4.15: Bệnh tụ huyết trùng lợn, trang 355-360; Phần 5.17: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm, trang

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2,3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho ngựời sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

4) Thông tin này đưa ra tao điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

5) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

...

...

...

7) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

8) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuân tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-56:2023 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 56: Bệnh tụ huyết trùng ở lợn, trâu, bò, gia cầm