7.3  Phát hiện kháng thể

Phát hiện kháng thể dịch tả lợn cổ điển có ý nghĩa chẩn đoán đối với lợn ốm có triệu chứng của bệnh dịch tả lợn cổ điển và chưa từng tiêm phòng, hoặc nhiễm vi rút dịch tả lợn từ trước.

7.3.1  Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể

Sử dụng kít ELISA phát hiện kháng thể theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Các bước tiến hành tham khảo Phụ lục E.

7.3.2  Phương pháp trung hòa kháng thể dịch tả lợn trên môi trường tế bào

Ngoài mục đích chẩn đoán bệnh, phương pháp phát hiện kháng thể bằng phương pháp trung hòa trên tế bào còn có ý nghĩa đánh giá hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng vắc xin CSF. Phương pháp này để xác định hàm lượng kháng thể có trong huyết thanh nhờ sự ức chế của kháng thể đối với CSFV được gây nhiễm trên tế bào.

Các bước tiến hành tham khảo Phụ lục F.

8  Kết luận

...

...

...

- Phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên dương tính.

- Phương pháp realtime RT-PCR phát hiện vi rút dương tính.

- Phân lập được vi rút trên môi trường tế bào, và giám định vi rút dịch tả lợn dương tính.

- Phương pháp miễn dịch huỳnh quang dương tính.

- Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể dương tính ở lợn chưa tiêm phòng.

- Phương pháp trung hòa trên tế bào dương tính (chỉ áp dụng đối với lợn chưa tiêm phòng trong trường hợp chẩn đoán).

Phụ lục A

(Quy định)

...

...

...

A.1  Dung dịch Glutamin/kháng sinh 100 lần (100 X)

- Dung Dịch A:

Thành phần:

Glutamin

2,92 g

Nước cất hai lần

50 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên rồi lọc qua màng lọc có kích thước 0,45 µm.

...

...

...

Thành phần:

Penicillin

1000000 UI

Streptomycin

1g

Mycostatin

500000 UI

...

...

...

Polymicin

150000 UI

Kanamycin

1 g

Nước cất hai lần

10 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên bằng cách lắc đều.

...

...

...

Thành phần: Dung dịch A, dung dịch B và nước cất hai lần.

Cách chuẩn bị: Hòa tan 50 ml dung dịch A, 10 ml dung dịch B và 40 ml nước cất hai lần và đem bảo quản ở âm 20 °C.

A.2  Dung dịch muối đệm Hank's (BSS) hoặc môi trường Hank’s MEM

Pha theo chỉ dẫn của hãng sản xuất. Sau đó, hấp vô trùng 121 °C trong thời gian 15 phút và bảo quản ở 4 °C.

A.3  Môi trường nuôi cấy tế bào Eagle’s MEM

Thành phần:

Môi trường Eagle’s MEM

9,4 g

...

...

...

1000 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Sau đó, hấp vô trùng 121 °C trong thời gian 15 phút và bảo quản ở 4 °C.

A.4  Dung dịch Trypsin 0,5 % (10 X)

Thành phần:

Trypsin 1:250

5g

Nước cất hai lần

1000 ml.

...

...

...

A.5  Dung dịch muối đệm phốt phát pH ~ 7,2 (PBS).

Thành phần

Natri clorua (NaCl)

8,0 g

Kali clorua (KCl)

0,2 g

Natri hydrophosphat (Na₂HPO₄)

1,15 g

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄)

...

...

...

Nước cất

1000 ml

Cách chuẩn bị

Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.6  Dung dịch đệm glycerin pH ~ 8,3

Thành phần:

Natri dihydrocacbonat (NaHCO₃)

0,0715 g

...

...

...

Dinatri cacbonat (Na₂CO₃)

0,00160g

Nước cất vô trùng

10 ml

Glycerin vừa đủ

100 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, dùng khi đọc huỳnh quang.

...

...

...

Thành phần:

Amino Ethyl Carbazole

2 mg

N, N-DiMethyl Formamide DMF

500 µl

0.05 M Acetate Buffer

9,5 ml

...

...

...

30% Hydrogen Peroxide H₂O₂

5 µl

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên, dùng ngay sau khi pha.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên vi rút dịch tả lợn

Hiện nay có nhiều kít ELISA phát hiện kháng nguyên vi rút dịch tả lợn khác nhau được cung cấp trên thị trường. Ví dụ, sử dụng kít IDEXX CSFV Ag serum plus của hãng IDEXX Cat.no: 99-40939 3) thì các bước được thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

...

...

...

- Chuẩn bị pha loãng mẫu xét nghiệm: Mẫu huyết thanh hoặc huyết tương xét nghiệm và mẫu đối chứng được pha loãng 1/2. Thay đổi đầu típ cho mỗi mẫu, ghi lại ký hiệu mẫu theo sơ đồ bố trí phản ứng trên đĩa và phải lắc đều mẫu trước khi pha loãng.

- Chuẩn bị nước rửa: Lắc đều dung dịch nước rửa có nồng độ đậm đặc 10 lần để hòa tan hết một vài thành phần muối. Pha loãng 1/10 từ dung dịch đậm đặc 10 lần với nước cất hai lần trước khi sử dụng.

B.2  Thực hiện phản ứng

- Cho 50 µl dung dịch kháng thể phát hiện (Detection antibodies) vào từng giếng.

- Cho 50 µl mẫu đối chứng âm vào giếng A1, B1.

- Cho 50 µl mẫu đối chứng dương vào giếng C1, D1.

- Cho 50 µl mẫu xét nghiệm vào từng giếng tương ứng với sơ đồ xét nghiệm. Lắc đều đĩa.

- Ủ 2 giờ ở 37 °C hoặc ủ qua đêm (12 giờ đến 18 giờ) ở 2 °C đến 8 °C. Dán kín đĩa để tránh bay hơi.

- Sau khi kết thúc giai đoạn ủ, rửa đĩa 5 lần với nước rửa. Mỗi giếng rửa với khoảng 300 µl nước rửa. Làm sạch nước rửa có trong giếng sau khi rửa. Tránh làm khô đĩa trước khi bổ sung conjugate.

...

...

...

- Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng 18 °C đến 25 °C.

- Sau khi kết thúc giai đoạn ủ, rửa đĩa 5 lần với nước rửa.

- Cho 100 µl dung dịch TMB vào tất cả các giếng phản ứng.

- Ủ 10 phút ở nhiệt độ 18 °C đến 25 °C.

- Cho 100 µl dung dịch Stop vào tất cả các giếng phản ứng.

- Đọc đĩa ở bước sóng 450 nm bằng máy đọc ELISA (5.10)

- Tính toán kết quả.

B.3  Kết quả

- Đánh giá kết quả

...

...

...

Đối với các kết quả không hợp lệ, khảo nghiệm phải được lặp lại.

Sự có mặt hay không có mặt của kháng nguyên dịch tả lợn trong mẫu được xác định bởi giá trị OD (SN) cho mỗi mẫu.

- Phân tích kết quả

Trung bình mẫu đối chứng âm: NC = (giếng A1 + giếng B1)/2

Trung bình mẫu đối chứng dương: PC = (giếng C1 + giếng D1)/2

Mẫu xét nghiệm (S - NC): S - NC = mẫu - NC

- Giải thích kết quả

Nếu mẫu cỏ giá trị (S - NC) ≤ 0,300: mẫu âm tính với CSFV.

Nếu mẫu có giá trị (S - NC) > 0,300: mẫu dương tính và cần được xác nhận với một thử nghiệm cụ thể CSFV để xác định BVD, BVDV hay CSFV.

...

...

...

Phụ lục C

(Tham khảo)

Quy trình chiết tách ADN/ARN

Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp. Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kít/ KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 thì các bước được thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

...

...

...

- Hút 200 µl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

- Giải đông, vortex huyễn dịch 10 % mẫu đã chuẩn bị ở mục 7.1.2. Sau đó tiến hành ly tâm 2500 g trong 15 phút. Hút 200 µl dịch trong bên trên vào ống Lysis buffer và trộn đều.

- Ly tâm lắng (5.2.4) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.3) và sắp xếp thứ tự trên khay.

- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi ADN/ARN của kít.

- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 µl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 µl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 µl dung dịch Elution Buffer.

- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 µl dung dịch hạt từ.

- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

...

...

...

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

- Hút toàn bộ dung dịch trong giếng đĩa thu ADN/ARN cho vào ống thu hồi 500 µl vô trùng đã ghi sẵn ký hiệu mẫu chiết tách tương ứng.

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp realtime RT-PCR để phát hiện vi rút dịch tả lợn

Bảng D.1 - Trình tự mồi và đoạn dò

Mồi và đoạn dò

...

...

...

Theo Risatti

Mồi xuôi CSFV

CCCTGGGTGGTCTAAG

Mồi ngược CSFV

CATGCCCTCGTCCAC

Đoạn dò CSFV

FAM-CCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTT-TAMRA

Theo Hoffmann

Mồi xuôi CSFV

...

...

...

Mồi ngược CSFV

CTACTGACGACTGTCCTGTAC

Đoạn dò CSFV

FAM-TGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT-TAMRA

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng realtime RT-PCR

STT

Thành phần nguyên liệu

(Theo hướng dẫn của kít Invitrogen Superscript III qRT - PCR Kit)

Nồng độ

...

...

...

Thể tích cho 1 phản ứng

µl

1

Nước không có RNAse và DNAse

5,5

2

Dung dịch đệm 2X

...

...

...

3

Mồi xuôi CSFV

20

0,5

4

Mồi ngược CSFV

20

0,5

5

...

...

...

6

0,5

6

Enzyme Mix

0,5

7

Mẫu chiết tách (ARN)

...

...

...

Tổng thể tích cho 1 phản ứng:

25

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt phản ứng realtime RT-PCR

Nhiệt độ

°C

Thời gian

Số chu kỳ

50 (*)

15 phút (*)

...

...

...

95 (*)

2 phút (*)

01

95

15 giây

45

60

45 giây
(ghi nhận tín hiệu quang)

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít SuperScript ® III Platinum ® One step Quantitative RT-PCR System, Cat. No.: 11732-020 của hãng Invitrogen.

...

...

...

PHỤ LỤC E

(Tham khảo)

Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể vi rút dịch tả lợn

Hiện nay có nhiều kít ELISA phát hiện kháng thể vi rút dịch tả lợn khác nhau được cung cấp trên thị trường. Ví dụ, sử dụng kít Priocheck® CSFV Ab 2.0. CSFV antibody test kit4) của Prionics Thermo Fisher Scientific thì các bước được thực hiện như sau:

E.1  Chuẩn bị

Để tất cả nguyên liệu ra ngoài nhiệt độ phòng (18 °C đến 25 °C) và lắc đều trước khi sử dụng.

Chuẩn bị nước rửa: Lắc đều dung dịch nước rửa có nồng độ đậm đặc 200 lần để hoà tan hết một vài thành phần muối. Pha loãng 1/200 từ dung dịch đậm đặc 200 lần với nước cất hai lần trước khi sử dụng.

E.2  Thực hiện phản ứng

- Cho 20 µl dung dịch pha loãng mẫu vào tất cả các giếng theo sơ đồ xét nghiệm.

...

...

...

- Cho 80 µl mẫu đối chứng dương yếu vào giếng C1, D1.

- Cho 80 µl mẫu đối chứng dương mạnh vào giếng E1, F1.

- Cho 80 µl mẫu xét nghiệm vào các giếng còn lại theo sơ đồ.

- Dán kín đĩa.

- Lắc đều đĩa.

- Ủ 60 phút ± 5 phút ở nhiệt độ 37 °C ± 1 °C.

- Sau khi kết thúc giai đoạn ủ, rửa đĩa 6 lần với nước rửa.

- Cho 100 µl dung dịch Conjugate vào tất cả các giếng phản ứng.

- Dán kín đĩa.

...

...

...

- Sau khi kết thúc giai đoạn ủ, rửa đĩa 6 lần với nước rửa.

- Cho 100 µl dung dịch TMB vào tất cả các giếng phản ứng.

- Ủ 20 phút ± 1 phút ở nhiệt độ 22 °C ± 3 °C.

- Cho 100 µl dung dịch Stop vào tất cả các giếng phản ứng.

- Đọc đĩa ở bước sóng 450 nm bằng máy đọc ELISA (5.10).

- Tính toán kết quả.

E.3  Kết quả

- Tính giá trị trung bình 450 nm của đối chứng âm (giếng A1 và B1). Đây chính là giá trị OD max.

- Tính phần trăm ức chế (PI) của đối chứng dương yếu và đối chứng dương mạnh trong đĩa phản ứng và giá trị PI của mẫu xét nghiệm được tính theo công thức như sau:

...

...

...

- Đánh giá kết quả

Phản ứng có giá trị khi:

+ Giá trị OD trung bình của đối chứng âm phải lớn hơn 1,0 (ODmax > 1,0).

+ PI của mẫu đối chứng dương yếu phải lớn hơn 50 % (PI > 50 %).

+ PI của mẫu đối chứng dương mạnh phải lớn hơn 80 % (PI > 80 %).

Phản ứng không chấp nhận nếu không đạt các giá trị nêu trên.

- Phân tích kết quả

Nếu giá trị PI < 40 %: mẫu không có kháng thể đặc hiệu với vi rút dịch tả lợn.

Nếu giá trị PI ≥ 40 %: mẫu có kháng thể đặc hiệu với vi rút dịch tả lợn.

...

...

...

PHỤ LỤC F

(Tham khảo)

Phương pháp trung hòa kháng thể dịch tả lợn trên môi trường tế bào (phản ứng NPLA)

F.1  Chuẩn bị

- Huyết thanh cần xét nghiệm đầu tiên phải được bất hoạt ở 56°C trong 30 phút.

- Pha loãng huyết thanh cần xét nghiệm với môi trường MEM (4.3.1) có chứa 5 % FBS (4.3.2) theo bậc 2 bắt đầu từ 1/4 (độ pha loãng huyết thanh cuối cùng là 1/8). Kể cả huyết thanh đối chứng dương và âm.

- Cho 50 µl huyết thanh đã pha loãng vào đĩa tế bào 96 giếng (4.3.8), mỗi nồng độ 2 giếng.

LƯU Ý: Cần có huyết thanh đối chứng dương và âm để kiểm soát phản ứng.

- Cho 50 µl vi rút dịch tả lợn cổ điển (4.3.7) ở nồng độ 200 TCID₅₀/ 50 µl được pha trong môi trường MEM (4.3.1) có chứa 5 % FBS (4.3.2) vào tất cả các giếng.

...

...

...

- Cho 100 µl 3 x 10⁴ tế bào PK 15/ml pha trong môi trường MEM (4.3.1) có chứa 5 % FBS (4.3.2) vào tất cả các giếng.

- Vi rút dịch tả lợn cổ điển (4.3.7) ở nồng độ 100 TCID₅₀/ 50 µl phải được chuẩn độ lại và ủ cùng với đĩa trung hoà.

- Ủ đĩa trong tủ ấm (5.22 ) ở 37 °C và 5% CO₂ trong 3 ngày đến 4 ngày.

- Cố định tế bào: Đổ bỏ môi trường trong đĩa và rửa đĩa bằng dung dịch đệm PBS có 1 % Tween 80 từ 2 đến 3 lần (200 µl/giếng). Cho vào mỗi giếng 100 µl dung dịch cố định PBS có 1 % Tween 20, 10 % formaline, 1 % NP 40. Ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.

- Rửa đĩa 3 lần bằng PBS có 1 % Tween 80.

- Cho 50 µl kháng thể dịch tả lợn đơn dòng (4.3.4) đã được pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất trong PBS vào mỗi giếng, ủ 37 °C trong 30 phút.

- Rửa đĩa 3 lần bằng PBS có 1 % Tween 80.

- Cho 50 µl kháng thể thứ cấp (Anti-pig IgG peroxidase conjugate hoặc Anti-mouse HRPO conjugate) đã được pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất trong PBS vào mỗi giếng, ủ 37 °C trong 30 phút.

- Rửa đĩa 3 lần bằng PBS có 1 % Tween 80.

...

...

...

F.3  Đọc kết quả

- Quan sát đĩa bằng kính hiển vi soi ngược.

- Nguyên sinh chất của tế bào bắt màu đỏ đậm (màu của ACE), kết luận không có kháng thể.

- Nguyên sinh chất của tế bào không bắt màu, kết luận có kháng thể.

Tính hiệu giá kháng thể trung hòa của mẫu huyết thanh:

- Độ pha loãng của huyết thanh phải chuyển về log₁₀ (huyết thanh pha loãng 1/X, lấy Iog10 của X) để đưa vào công thức Karber (1931).

Hiệu giá trung hòa 50% = a + 0,5 - 1/n x Ʃrl

Với: a: độ pha loãng huyết thanh cao nhất có ít nhất một giếng có bắt màu.

Ʃrl: tổng số giếng không có bắt mầu trong các độ pha loãng có ít nhất một giếng có bắt màu.

...

...

...

F.4  Điều kiện để chấp nhận kết quả

- Một xét nghiệm có giá trị và kết quả chấp nhận nếu đối chứng và nồng độ của vi rút nằm trong khoảng chấp nhận:

+ Hiệu giá của mẫu đối chứng huyết thanh âm tính có hiệu giá nhỏ hơn 1/8.

+ Hiệu giá của mẫu đối chứng huyết thanh dương tính có giá trị tương đương với giá trị đã biết (± 1 độ pha loãng).

+ Hiệu giá chuẩn độ lại vi rút (200TCID₅₀) phải nằm trong khoảng log₁₀ 1,5 - 2,5.

- Mẫu huyết thanh được xem là dương tính nếu nồng độ trung hòa vi rút lớn hơn hoặc bằng 1/8. Tất cả các mẫu được cho là dương tính trong trường hợp xét nghiệm lặp lại được xác định là dương tính.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE (Office International des Epizooties), 2014. Classical Swine Fever (Infection with Classical Swine Fever). Chapter 2.8.3. Terrestrial Manual

...

...

...

[3] Chi cục Thú y vùng VI, 2017, Quy trình phát hiện kháng nguyên Dịch tả lợn bằng kỹ thuật ELISA.

[4] Chi cục Thú y vùng VI, 2017, Quy trình phát hiện kháng thể Dịch tả lợn bằng kỹ thuật ELISA.

[5] Chi cục Thú y vùng VI, 2017, Quy trình phát hiện vi rút gây bệnh Dịch tả lợn (CSFV) bằng kỹ thuật realtime RT-PCR.

[6] Hoffmann B., Beer M., Schelp C., Schirrmeoer H. and Depner K., 2005, Validation of a real-time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever. J. Virol. Methods 130:36-44

[7] Risatti G.R., Callahan J.D., Nelson W.M. and Borca M.V., 2003, Rapid detection of Classical swine fever virus by a portable Real-Time PCR reverse transcriptase PCR assay. Journal of clinical microbiology 41(1): 500-505

1) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

2) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

3) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

4) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-47:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển